熱預(yù)處理和氧化預(yù)處理對(duì)鼠李糖乳桿菌噴霧干燥菌粉性質(zhì)的影響

張臣臣，桂 亞，韓越眉，瓦云超，印伯星，顧瑞霞,

（1.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225127；2.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225127；3.揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司，江蘇省乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，江蘇揚(yáng)州 225004；4.江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，糧食與食品藥品學(xué)院，江蘇淮安 223023）

乳酸菌及其發(fā)酵乳制品已成為目前受歡迎的益生菌功能食品之一[1]。乳酸菌的活性是其在食品中進(jìn)行發(fā)酵和人體內(nèi)發(fā)揮益生作用的必要基礎(chǔ)。研究人員認(rèn)為，乳酸菌的日攝入量達(dá)到109菌落形成單位（colony forming unit，CFU）方能發(fā)揮較好的益生功能[2]。然而，乳酸菌在生產(chǎn)、貯藏、運(yùn)輸和消費(fèi)過(guò)程中，會(huì)受到工藝流程、宿主、及自身代謝產(chǎn)物等多種脅迫，引起活性損失[3]。

低溫和干燥是目前最有效的微生物活性維持條件。干燥菌粉活菌數(shù)高、活性穩(wěn)定、貨架期長(zhǎng)，冷鏈、運(yùn)輸和貯藏成本低，便于后續(xù)加工，是發(fā)酵劑和益生菌制劑的主要產(chǎn)品形式。噴霧干燥法將乳酸菌培養(yǎng)物霧化后，置于高溫的流動(dòng)熱空氣中，達(dá)到快速干燥的目的，主要生產(chǎn)設(shè)備噴霧干燥塔是乳品工業(yè)的基礎(chǔ)設(shè)施，工藝成熟、干燥快速且連續(xù)生產(chǎn)能力強(qiáng)。噴霧干燥法生產(chǎn)成本只有冷凍干燥法的20%左右，能耗為冷凍干燥的1/10～1/16[4]。乳酸菌培養(yǎng)物甚至可以直接隨食品一同噴霧干燥，使產(chǎn)品具有更好的均一性，并進(jìn)一步簡(jiǎn)化生產(chǎn)流程，降低生產(chǎn)成本。隨著乳酸菌奶粉、乳酸菌米粉、乳酸菌豆粉、乳酸菌慕斯粉、乳酸菌冰激凌粉及含乳酸菌食品原料等產(chǎn)品的興起，噴霧干燥法展現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。然而，較低的存活率和穩(wěn)定性仍限制噴霧干燥法的進(jìn)一步應(yīng)用。

在噴霧干燥過(guò)程中，乳酸菌直接暴露于高溫的空氣中，其活性損失主要來(lái)自于生產(chǎn)過(guò)程中的熱脅迫和氧化脅迫，氧化脅迫同時(shí)是乳酸菌貯藏期間面臨的最主要脅迫[1]。乳酸乳球菌和雙歧桿菌的噴霧干燥存活率與其熱脅迫和氧化脅迫耐受能力呈正相關(guān)[5-6]。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）hsryfm 1301分離自中國(guó)巴馬的長(zhǎng)壽老人，具有明顯的功能特性[7]。該菌株對(duì)熱脅迫和氧化脅迫存在明顯的交叉適應(yīng)，熱預(yù)處理或氧化預(yù)處理均能夠同時(shí)提高菌株的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力[8]，但是兩種預(yù)處理方法是否能夠提高鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的噴霧干燥存活率及其提高水平仍不清晰。本文探究熱預(yù)處理或氧化預(yù)處理對(duì)鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301噴霧干燥存活率及后續(xù)耐貯藏能力的影響，以期為噴霧干燥在鼠李糖乳桿菌菌粉生產(chǎn)中的應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 于2013年分離自廣西省巴馬瑤族自治縣的長(zhǎng)壽老人，具有顯著的降血脂功能[7]，現(xiàn)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC No. 8545）；胃蛋白酶（1:10000）、牛膽鹽

北京索萊寶科技有限公司；30% H2O2國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；de Man Rogosa Sharpe （MRS）培養(yǎng)基 蛋白胨 10.0 g/L，牛肉浸粉 8.0 g/L，酵母浸粉4.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L，磷酸氫二鉀 2.0 g/L，檸檬酸氫二銨 2.0 g/L，乙酸鈉 5.0 g/L，硫酸鎂 0.2 g/L，硫酸錳 0.04 g/L，吐溫80 1.0 g/L，pH6.5±0.2。

GL-10MD大容量高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；MOBILE MINOR噴霧干燥機(jī) 德國(guó)GEA Grop集團(tuán)；HH-8水浴鍋 上海力辰邦西儀器科技有限公司；JF-SX-500全自動(dòng)滅菌鍋

日本TOMY公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-150BSH生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng) 從凍存管中取鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的凍干菌粉（約0.5 g），置于5 mL MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h；將菌液在MRS固體培養(yǎng)基上劃線純化；挑取單菌落，在MRS液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h；4 ℃保藏備用。

1.2.2 熱預(yù)處理 熱預(yù)處理?xiàng)l件參照前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行[8-9]，將活化的鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301按2%（v/v）的接種量轉(zhuǎn)接到600 mL MRS液體培養(yǎng)基中，混勻，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm為1.8，然后將培養(yǎng)好的菌液放置46 ℃水浴鍋中熱處理1 h。對(duì)照組不進(jìn)行熱預(yù)處理。

1.2.3 氧化預(yù)處理 氧化預(yù)處理?xiàng)l件參照前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行[8-9]，將活化的鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301按2%（v/v）的接種量轉(zhuǎn)接到600 mL MRS液體培養(yǎng)基中，混勻，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm為2.0左右。然后將培養(yǎng)好的菌液離心，PBS重懸后，添加終濃度為0.5 mmol/L的H2O2，37℃下預(yù)處理1 h。對(duì)照組不進(jìn)行氧化預(yù)處理。

1.2.4 噴霧干燥條件 使用大容量高速冷凍離心機(jī)將對(duì)照、熱預(yù)處理和氧化預(yù)處理后的菌液以4000 ×g的轉(zhuǎn)速離心20 min，倒掉上清液，得到鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301菌泥。將菌泥重懸于0.6 L保護(hù)劑，充分混勻。將混懸液進(jìn)行噴霧干燥（噴霧前MRS平板計(jì)數(shù)；噴霧干燥參數(shù)：進(jìn)風(fēng)120 ℃，出風(fēng)60 ℃，流速8.5 mL/min）[10-11]。對(duì)噴霧干燥獲得的菌粉進(jìn)行MRS平板計(jì)數(shù)[12]，噴霧干燥存活率通過(guò)公式（1）計(jì)算。噴霧干燥保護(hù)劑：脫脂乳150.0 g/L，海藻糖90.0 g/L，甘油8.0 ml/L，加水定容至1 L[11,13]。

1.2.5 噴霧干燥菌粉對(duì)人工胃液的耐受能力 分別稱取對(duì)照組、熱預(yù)處理組和氧化預(yù)處理組噴霧干燥菌粉1.0 g，用9.0 mL PBS懸浮菌體，混勻。取1.0 mL的菌懸浮液轉(zhuǎn)接至9.0 mL的pH 2.5人工胃液，37 ℃培養(yǎng)3 h，分別在0和3 h利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)[12]，通過(guò)公式（2）計(jì)算其存活率（%）。

0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液：準(zhǔn)確稱取8.0 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4溶于700 mL蒸餾水中，用1.0 mol/L HCl調(diào)pH為7.2～7.4，最后定容至1 L。高壓滅菌后（121 ℃，15 min），低溫保藏（4 ℃），備用。

模擬胃液配制方法：準(zhǔn)確稱取0.5 g NaCl，0.3 g胃蛋白酶溶于50 mL蒸餾水中，用1.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為2.5，最后定容至100 mL，過(guò)濾除菌（0.22 μm濾膜），4 ℃低溫保藏[14]。

1.2.6 噴霧干燥菌粉對(duì)膽鹽的耐受能力 膽鹽是益生菌在人體腸道中面臨的主要脅迫，大量益生菌篩選研究用膽鹽培養(yǎng)基模擬腸道脅迫[14]。分別稱取對(duì)照組、熱預(yù)處理組和氧化預(yù)處理組噴霧干燥菌粉1.0 g，用9.0 mL PBS懸浮菌體，混勻。取1.0 mL的菌懸浮液轉(zhuǎn)接至9.0 mL的含0.1%膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h，分別在0和3 h利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)[12]，通過(guò)公式（2）計(jì)算其存活率（%）。

膽鹽培養(yǎng)基配制方法：準(zhǔn)確稱取一定量的膽鹽溶于MRS液體培養(yǎng)基中，使其膽鹽濃度（w/v）為0.1%，用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為6.5±0.2，高壓滅菌后（121 ℃，15 min），冷卻備用[14]。

1.2.7 噴霧干燥菌粉在貯藏期內(nèi)活菌數(shù)的變化 將對(duì)照噴霧干燥菌粉、熱預(yù)處理噴霧干燥菌粉和氧化預(yù)處理噴霧干燥菌粉分別放置-20 ℃、4 ℃和室溫（25 ℃）下密封避光貯藏[15]。用MRS固體培養(yǎng)基對(duì)菌粉進(jìn)行平板計(jì)數(shù)（前5個(gè)周每周1次，后續(xù)每月1次）[12]。存活率通過(guò)公式（1）計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次平行；采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05 為差異顯著；使用Origin和Visio進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱預(yù)處理和氧化預(yù)處理對(duì)菌株噴霧干燥存活率的影響

熱預(yù)處理和氧化預(yù)處理未對(duì)菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生大的影響，同等生長(zhǎng)時(shí)間活菌數(shù)均可以達(dá)到1×108CFU/mL以上。未經(jīng)熱預(yù)處理的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301菌液經(jīng)噴霧干燥后存活率僅為29%，而經(jīng)過(guò)熱脅迫處理菌液經(jīng)噴霧干燥后存活率達(dá)到了98%，存活率提高到原來(lái)的3.38倍（圖1）。氧化預(yù)處理同樣可以提高鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301在噴霧干燥中的存活率。氧化預(yù)處理后菌液經(jīng)噴霧干燥存活率約為76%，相較于未經(jīng)氧化脅迫處理的菌株的噴霧干燥存活率提高了約1.62倍（圖1）。這說(shuō)明菌株經(jīng)過(guò)46 ℃熱脅迫或0.5 mmol/L H2O2氧化脅迫后，菌體獲得的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力，有助于其在噴霧干燥中存活。

圖 1 熱預(yù)處理和氧化預(yù)處理后菌株的噴霧干燥存活率Fig.1 Survival rates of heat pre-treated or oxidative pre-treated L. rhamnosus hsryfm 1301 cells during spray drying

已有研究表明，熱預(yù)處理能夠提高一些乳桿菌的噴霧干燥存活率。對(duì)植物乳桿菌299V和嗜酸假單胞菌HA-61112分別進(jìn)行49.5和50 ℃脅迫處理后，這兩株菌在噴霧干燥過(guò)程中細(xì)胞活性沒(méi)有顯著降低[16]。同樣較溫和的熱處理?xiàng)l件（52 ℃, 15 min）不會(huì)影響植物乳桿菌8329噴霧干燥前的細(xì)胞活性，卻能顯著提高其噴霧干燥的存活率[17]。除熱預(yù)處理能夠賦予乳酸菌較高的熱和噴霧干燥的耐受性外，酸、膽鹽、滲透壓、氧化脅迫也能達(dá)到類似效果。Desmond等發(fā)現(xiàn)將副干酪乳桿菌NFBC 338暴露于亞致死濃度H2O2（3 mmol/L）、鹽溶液（0.3 mol/L NaCl）中，可以顯著提高噴霧干燥的存活率[18]。

本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱預(yù)處理或氧化預(yù)處理同樣能夠提高鼠李糖乳桿菌的噴霧干燥存活率，但是與文獻(xiàn)報(bào)道的其它乳桿菌所需要的預(yù)處理?xiàng)l件強(qiáng)度有所不同，表明不同菌種對(duì)脅迫的預(yù)適應(yīng)能力存在差異。作者的前期研究表明，熱預(yù)處理或氧化預(yù)處理除了能夠提高菌株對(duì)同種脅迫的耐受之外，還存在交叉保護(hù)作用。經(jīng)溫和熱預(yù)處理后，菌株的氧化脅迫耐受能力提高13倍；經(jīng)溫和氧化預(yù)處理后，菌株的熱脅迫耐受能力提高150倍[8]。因此，預(yù)處理手段對(duì)噴霧干燥過(guò)程中菌體的保護(hù)可能存在多種機(jī)制。熱預(yù)處理的效果好于氧化預(yù)處理，可能是由于熱脅迫是噴霧干燥中的最主要脅迫[19]。這種預(yù)處理賦予的保護(hù)作用可能是由于特定脅迫蛋白的合成所致。已有研究證明噴霧干燥前熱脅迫蛋白（尤其是負(fù)責(zé)預(yù)防或修復(fù)錯(cuò)誤折疊多肽的蛋白或分子伴侶）的過(guò)量產(chǎn)生是保護(hù)菌體免受干燥損傷的有效手段，Prasad等[20]利用二維凝膠電泳和N端測(cè)序分析了鼠李糖乳桿菌在熱脅迫條件下的蛋白質(zhì)合成，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)GroEL和DnaK，糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶和ABC運(yùn)輸相關(guān)蛋白質(zhì)上調(diào)。

2.2 熱預(yù)處理和氧化預(yù)處理對(duì)噴霧干燥菌粉胃腸道環(huán)境耐受能力的影響

胃腸道中的酸脅迫和膽鹽脅迫是益生菌在腸道中定殖所面臨的主要脅迫。對(duì)照組菌粉在模擬人工胃液和0.1%膽鹽中的存活率為0.8%和72%。熱脅迫處理后噴霧干燥的菌粉對(duì)模擬人工胃液和0.1%膽鹽的耐受能力分別為76%、74%，與對(duì)照組菌粉相比，熱預(yù)處理菌株噴霧干燥菌粉的酸脅迫存活率提高了94.0倍（P＜0.05），耐膽鹽能力未受不良影響（P＞0.05）（圖2）。這表明熱脅迫處理不僅提高了菌株的噴霧干燥存活率，同時(shí)大幅提高了菌粉的胃酸耐受能力。氧化預(yù)處理菌粉對(duì)模擬人工胃液和0.1%膽鹽的存活率分別為72%和89%（圖2），耐酸、耐膽鹽能力分別提高了91.5倍和24%。因此，氧化脅迫處理不僅提高了菌株的噴霧干燥存活率，同時(shí)顯著提高了菌粉對(duì)胃腸道環(huán)境的耐受能力（P＜0.05）。

圖 2 熱預(yù)處理和氧化預(yù)處理噴霧干燥菌粉的胃腸道環(huán)境耐受能力Fig.2 Resistance of spray dried powder to simulated gastrointestinal digestion

圖 3 熱預(yù)處理和氧化預(yù)處理噴霧干燥菌粉在不同貯藏條件下的存活能力Fig.3 Survival rates of spray dried powder during storage

鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301噴霧干燥菌粉的耐膽鹽能力較強(qiáng)，對(duì)照組噴霧干燥菌粉的耐膽鹽（0.1%）存活率為72%，熱預(yù)處理對(duì)菌粉的耐膽鹽能力沒(méi)有負(fù)面影響，氧化預(yù)處理則進(jìn)一步提高了其耐膽鹽能力。鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301噴霧干燥菌粉的耐胃酸能力較弱，遠(yuǎn)低于未噴霧培養(yǎng)液中菌體的胃酸耐受能力[21]，可能是由于與耐酸相關(guān)的酶類或膜系統(tǒng)受到了損傷；但是經(jīng)熱預(yù)處理或氧化預(yù)處理后，其胃酸耐受能力均大幅提升，表明預(yù)處理手段減輕了噴霧過(guò)程中耐酸相關(guān)的酶類或膜系統(tǒng)受到的損傷。上述結(jié)果表明預(yù)處理重建了噴霧干燥菌粉的胃酸耐受能力，使其能夠更好地通過(guò)胃腸道，有利于其發(fā)揮益生菌制劑應(yīng)有的功能。熱預(yù)處理和氧化預(yù)處理對(duì)菌體酸脅迫和膽鹽脅迫耐受能力的強(qiáng)化作用可能緣于菌體對(duì)脅迫的交叉適應(yīng)，但是具體機(jī)制仍有待研究[22]。

2.3 噴霧干燥菌粉活的耐貯藏能力

相較于冷凍干燥菌粉，噴霧干燥菌粉的耐貯藏能力較弱，本文分3種貯藏條件研究了不同預(yù)處理菌粉的耐貯藏能力。對(duì)照菌粉在常溫貯藏下活性僅能維持3周，隨后迅速損失，在一個(gè)月內(nèi)存活率即降至0（圖3c）；在4 ℃和-20 ℃條件下，耐貯藏能力較好且相似，在4個(gè)月內(nèi)一直維持在20%以上（初始為29%），且后期趨于平穩(wěn)，無(wú)下降趨勢(shì)（圖3a, 3b）。熱預(yù)處理組菌粉在-20 ℃的貯藏環(huán)境中存活率較為穩(wěn)定，貯藏120 d后，其存活率仍然大于80%，而且在貯藏后期存活率幾乎保持不變（圖3a）；在4 ℃環(huán)境下的耐貯藏能力稍弱，120 d儲(chǔ)藏后熱預(yù)處理組菌粉存活率下降到65%，但仍大幅高于對(duì)照菌株（圖3b）；在常溫下耐貯藏能力極弱，甚至弱于對(duì)照菌粉，存活率在3周內(nèi)即下降至0（圖3c）。氧化預(yù)處理組同樣在-20 ℃的貯藏條件下貯藏能力最好，菌粉貯藏120 d后存活率仍然可以維持在40%以上；4 ℃的貯藏能力稍弱，菌粉貯藏120 d后存活率下降到35%；氧化預(yù)處理組菌粉在這兩種條件下的表現(xiàn)均優(yōu)于對(duì)照組而劣于熱預(yù)處理組。氧化預(yù)處理組菌粉在常溫條件下活性下降同樣很快，貯藏3周內(nèi)即下降至0。

室溫條件不適于鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301噴霧干燥菌粉的貯藏，3種菌粉在室溫下存活率均大幅下降，1個(gè)月內(nèi)存活率均降至檢測(cè)限以下。貯藏溫度越低，貯藏效果越好，這與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的其它乳桿菌噴霧干燥菌粉和冷凍干燥菌粉的貯藏規(guī)律相符[23]。低溫條件下，熱預(yù)處理菌粉表現(xiàn)最好的耐貯藏能力，能夠在-20 ℃或者4 ℃下長(zhǎng)期保持較高活菌數(shù)。這表明噴霧干燥菌粉中的菌體仍維持一定的生理代謝活動(dòng)，在常溫下會(huì)導(dǎo)致菌體內(nèi)平衡失調(diào)或能源耗盡，導(dǎo)致菌體死亡。有研究表明較低的水分活度有利于菌粉的貯藏，但是需要較高的出風(fēng)溫度，進(jìn)而導(dǎo)致較低的存活率[15]。因此，通過(guò)比較熱預(yù)處理、氧化預(yù)處理及對(duì)照菌粉中菌體的轉(zhuǎn)錄組或代謝組數(shù)據(jù)，將有利于分析菌體耐貯藏的內(nèi)在機(jī)制，為提高耐菌粉貯藏能力提供理論支持。

3 結(jié)論

鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301經(jīng)噴霧干燥后能夠保持一定的活菌數(shù)量，熱預(yù)處理和氧化預(yù)處理可以有效提高菌株在噴霧干燥中的存活率、菌粉的胃腸道環(huán)境耐受能力和低溫下的耐貯藏能力。熱預(yù)處理比氧化預(yù)處理有更好的處理效果，不同預(yù)處理手段的不同效果，也為噴霧干燥中熱脅迫和氧化脅迫的耐受研究提供了新的切入點(diǎn)。本研究獲得的噴霧干燥菌粉存活率和胃腸道耐受能力較好，但是貯存條件較為苛刻，未來(lái)通過(guò)綜合不同預(yù)處理手段及培養(yǎng)條件，改進(jìn)噴霧干燥參數(shù)，將使噴霧干燥在菌粉生產(chǎn)中的應(yīng)用更進(jìn)一步。