長鏈非編碼RNA腦源性神經營養因子反義RNA靶向微小RNA-495-3p調控脂多糖誘導的大鼠肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應

高煒，張莉，金培田

慢性阻塞性肺疾病（以下簡稱“慢阻肺”）是呼吸系統常見的慢性氣道炎癥反應疾病，巨噬細胞參與慢阻肺的發生發展［1］，巨噬細胞的吞噬功能受損可導致慢阻肺病人病情加重，因此調控炎癥反應和抑制肺泡巨噬細胞凋亡是治療慢阻肺的重要機制［2-3］。研究發現，長鏈非編碼RNA（lncRNA）在多種疾病發生發展中具有重要作用，其中包含慢阻肺，有望成為診斷和治療慢阻肺的靶點［4］。腦源性神經營養因子反義RNA（brain-derived neurotrophic factor antisense，BDNF-AS）是一種lncRNA，研究發現lncRNA BDNF-AS在MPTP誘導的帕金森細胞模型中上調表達，敲除BDNF-AS通過調節微小RNA（miR）-125b-5p提高SH-SY5Y細胞的活力，抑制MPTP誘導的帕金森細胞自噬和凋亡［5］。抑制ln‐cRNA BDNF-AS可通過miR-130b-5p/PRDM5軸抑制急性脊髓損傷中的神經細胞凋亡［6］。研究表明miRNA也參與調控慢阻肺的發生發展［7］。過表達miR-495-3p可通過靶向下調TLR4的表達，抑制核因子-κB（NF-κB）通路，進而抑制炎性因子的產生，促進人牙周膜細胞增殖［8］。miR-495-3p過表達通過抑制鞘氨醇-1磷酸受體3（shingosine-1 phosphate re‐ceptor 3，S1PR3）并抑制上皮-間質轉化過程，從而減輕了輻射引起的肺纖維化［9］。然而lncRNA BDNFAS和miR-495-3p對肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應的影響及其機制還尚未可知，遂于2018年12月至2019年12月通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導大鼠肺泡巨噬細胞，研究lncRNA BDNF-AS和miR-495-3p對肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應的影響及lncRNA BDNF-AS是否通過靶向調控miR-495-3p的表達影響其巨噬細胞凋亡和炎癥反應。

1 材料與方法

1.1材料大鼠肺泡巨噬細胞NR8383（貨號XYR005）購自無錫欣潤生物公司；胎牛血清、Ham's F12k培養基購自上海慧穎生物公司；LPS購自北京馳明瑞生公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自上海撫生實業公司；酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自南京森貝伽生物公司；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自愛必信（上海）生物公司；B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）一抗購自青島捷世康生物公司；兔抗山羊IgG-HRP購自南京信帆生物公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin VFITC）、碘化丙啶（PI）試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京原平皓生物公司。

1.2細胞處理與分組大鼠肺泡巨噬細胞NR8383用含20%胎牛血清的Ham's F12k培養基于37℃、5%二氧化碳條件下培養，取對數期細胞用于實驗。將細胞分為Con組：細胞常規培養，LPS組：細胞給予LPS（1 mg/L）處理12 h。將BDNF-AS小分子干擾RNA（si-BDNF-AS）及其陰性對照（si-NC）、miR-495-3p及其陰性對照（miR-NC）轉染至NR8383細胞中再用1 mg/L的LPS處理，記為LPS+si-BDNF-AS組、LPS+si-NC組、LPS+miR-495-3p組、LPS+miR-NC組；將si-BDNF-AS分別與anti-miR-NC、anti-miR-495-3p共轉染至NR8383細胞中，再用1 mg/L的LPS處理，記為LPS+si-BDNF-AS+anti-miR-NC組、LPS+si-BDNF-AS+anti-miR-495-3p組。將BDNF-AS過表達質粒（pcDNA-BDNF-AS）、空載體質粒（pcDNA）、BDNF-AS小干擾RNA（si-BDNF-AS）、小干擾RNA陰性對照（si-NC）轉染NR8383細胞，記為pcDNABDNF-AS組、pcDNA組、si-BDNF-AS組、si-NC組。

1.3實時熒光定量PCR檢測lncRNABDNF-AS和miR-495-3p的表達水平各組細胞培養24 h，提取總RNA，將RNA反轉錄成互補DNA（cDNA），按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR，每個樣品設3個重復，循環條件為95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s；72℃30 s，共40個循環；60℃延長5 min。相對表達量用2?ΔΔCt法計算。lncRNA BDNF-AS和miR-495-3p分別以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和U6為內參，lncRNA BDNF-AS正向引物序列：5'-TACCA‐CAAGGTACCAACCATATATG-3'，反向引物序列：5'-CATGTGGTTCTGTTTCAATGCCC-3'；GAPDH正 向引物序列：5'-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3'，反向引物序列：5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3'；miR-495-3p正向引物序列：5'-GCGGAAACAAA‐CATGGTGCA-3'，反向引物序列：5'-CTTGCTTCG‐GCATCACA-3'；U6正向引物序列：5'-CGCTTCG‐GCAGCACATATACTA-3'，反向引物序列：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3'；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4ELISA檢測IL-1β、TNF-α水平各組細胞培養24 h后取上清，具體按照試劑盒操作進行檢測。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡將0.25%蛋白酶消化的細胞，接種到無胎牛血清培養基過夜，24 h后收集細胞，每組選擇3個樣本，PBS洗滌1次，100μL接種于5 mL流式試管中，5μL的Annexin V-FITC與5μL PI混合后染色，無光條件下，孵育15 min后注入400μL結合緩沖液混勻，予以洗滌，后采用流式細胞儀分析細胞凋亡程度。

1.6蛋白質印跡法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達取各組細胞，提取總蛋白后用BCA法進行定量分析，首先進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），電泳完成后經電轉將蛋白轉移至甲醇活化的聚偏二氟乙烯（PVDF）上，用5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，加入稀釋的Bcl-2、Bax一抗（1∶600），4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗（1∶1 000），室溫孵育2h，洗膜、顯影、定影后，用ECL熒光試劑盒測定結果，拍照并進行蛋白條帶灰度值分析，然后計算與GAPDH比值求得Bcl-2、Bax蛋白的相對表達含量。

1.7熒光素酶報告實驗檢測BDNF-AS對miR-495-3p的靶向調控利用點突變技術構建BDNFAS野生型（WT）和突變型（MUT）基因靶點熒光素酶表達載體后，分別將野生型和突變型BDNF-AS3′非翻譯區（3′-UTR）插入LipofectamineTM2000載體，然后按照轉染試劑說明書將其分別與miR-NC和miR-495-3p共轉染至NR8383細胞中，轉染48 h后，嚴格按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作步驟檢測各組細胞熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNABDNF-AS、si-NC、si-BDNF-AS轉染至NR8383細胞中，按照“1.3”中方法檢測miR-495-3p表達水平。

1.8統計學方法采用SPSS20.0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，兩組間比較行成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析+LSD法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1lncRNABDNF-AS和miR-495-3p在LPS刺激的大鼠肺泡巨噬細胞中的表達與Con組相比，LPS組大鼠肺泡巨噬細胞中BDNF-AS表達水平升高［（1.00±0.06）比（3.41±0.31），t=22.90，P<0.001］，miR-495-3p表達水平降低［（1.02±0.07）比（0.47±0.04），t=20.47，P<0.001］。

2.2抑制lncRNABDNF-AS表達對LPS誘導的大鼠肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應的影響與Con組相比，LPS組大鼠肺泡巨噬細胞中BDNF-AS表達水平顯著升高，IL-1β、TNF-α水平升高，細胞凋亡率升高，Bax表達水平顯著升高，Bcl-2表達水平降低；與LPS+si-NC組相比，LPS+si-BDNF-AS組大鼠肺泡巨噬細胞中BDNF-AS表達水平降低，IL-1β、TNF-α水平降低，細胞凋亡率降低，Bax表達水平降低，Bcl-2表達水平升高，均差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1，表1。

圖1 抑制腦源性神經營養因子反義RNA（BDNF-AS）表達對脂多糖（LPS）誘導的大鼠肺泡巨噬細胞凋亡相關蛋白表達的影響

表1 抑制腦源性神經營養因子反義RNA（BDNF-AS）表達對脂多糖（LPS）誘導的大鼠肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應的影響/±s

表1 抑制腦源性神經營養因子反義RNA（BDNF-AS）表達對脂多糖（LPS）誘導的大鼠肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應的影響/±s

注：Bax為B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2，IL-1β為白細胞介素-1β，TNF-α為腫瘤壞死因子-α。①與Con組比較，P<0.05。②與LPS+si-NC組比較，P<0.05。

組別Con LPS LPS+si-NC LPS+si-BDNF-AS F值P值重復次數3 3 3 3 Bax 0.78±0.07 0.32±0.03①0.31±0.03 0.69±0.06②210.29<0.001 Bcl-2蛋白0.20±0.02 0.61±0.06①0.62±0.06 0.29±0.03②199.06<0.001 BDNF-AS 1.01±0.08 3.15±0.31①3.18±0.29 1.62±0.16②204.09<0.001 IL-1β/（ng/L）22.14±2.25 513.20±41.22①526.14±46.87 132.41±12.58②596.80<0.001 TNF-α/（ng/L）184.33±18.65 1 125.65±110.36①1 203.33±185.22 354.26±21.58②207.74<0.001凋亡率/%8.11±0.81 36.22±3.21①38.14±3.71 12.03±1.25②339.86<0.001

2.3miR-495-3p過表達對LPS誘導的大鼠肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應的影響結果表明，與LPS+miR-NC組相比，LPS+miR-495-3p組大鼠肺泡巨噬細胞中miR-495-3p表達水平升高，IL-1β、TNF-α水平降低，細胞凋亡率降低，Bax表達水平降低，Bcl-2表達水平升高，均差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2，表2。

表2 miR-495-3p過表達對脂多糖（LPS）誘導的大鼠肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應的影響/±s

表2 miR-495-3p過表達對脂多糖（LPS）誘導的大鼠肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應的影響/±s

注：Bax為B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2，IL-1β為白細胞介素-1β，TNF-α為腫瘤壞死因子-α。①與Con組比較，P<0.05。②與LPS+miR-NC組比較，P<0.05。

組別Con LPS LPS+miR-NC LPS+miR-495-3p F值P值重復次數3 3 3 3 Bax 0.77±0.07 0.31±0.03①0.29±0.03 0.63±0.06②198.06<0.001 Bcl-2蛋白0.21±0.02 0.60±0.06①0.61±0.06 0.33±0.03②168.67<0.001 miR-495-3p 1.00±0.06 0.42±0.04①0.40±0.03 0.78±0.07②277.96<0.001 IL-1β/（ng/L）26.34±2.61 524.33±49.65①536.14±51.02 175.98±18.41②433.04<0.001 TNF-α/（ng/L）193.22±19.24 1 232.11±121.54①1 248.65±115.28 628.47±53.69②300.05<0.001凋亡率/%7.25±0.73 34.58±3.41①36.98±3.61 14.87±1.42②283.57<0.001

圖2 miR-495-3p過表達對脂多糖（LPS）誘導的大鼠肺泡巨噬細胞凋亡相關蛋白的表達的影響

2.4lncRNABDNF-AS調控miR-495-3p表達（LncBasePredictedv.2）圖3顯示lncRNA BDNFAS、miR-495-3p具有相關結合點位。熒光素酶結果表明，同miR-NC組比較，miR-495-3p組轉染WTBDNF-AS活性下降［（1.00±0.05）比（0.38±0.04），t=25.79，P<0.001］；與miR-NC組比較，miR-495-3p組轉染MUT-BDNF-AS差異無統計學意義［（1.02±0.07）比（1.01±0.06），t=0.32，P=0.749］。pcDNA組（0.99±0.08）、pcDNA-BDNF-AS組（0.51±0.05）、si-NC組（1.00±0.07）及si-BDNF-AS組（2.98±0.28）的miR-495-3p表達水平比較，F=470.24，P<0.001；pcDNABDNF-AS組比pcDNA組低（P<0.05），si-BDNF-AS組比si-NC組高（P<0.05）。

圖3 腦源性神經營養因子反義RNA（BDNF-AS）的序列中含有與miR-495-3p互補的核苷酸序列

2.5沉默miR-495-3p抑制lncRNABDNF-AS表達對細胞活性及炎癥反應的影響與LPS+si-BDNFAS+anti-miR-NC組相比，LPS+si-BDNF-AS+antimiR-495-3p組miR-495-3p降低，IL-1β、TNF-α升高，細胞凋亡率升高，Bax表達水平升高，Bcl-2表達水平降低，均差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 干擾miR-495-3p表達逆轉了抑制腦源性神經營養因子反義RNA（BDNF-AS）表達對脂多糖（LPS）誘導的大鼠肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應的作用/±s

表3 干擾miR-495-3p表達逆轉了抑制腦源性神經營養因子反義RNA（BDNF-AS）表達對脂多糖（LPS）誘導的大鼠肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應的作用/±s

注：Bax為B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2，IL-1β為白細胞介素-1β，TNF-α為腫瘤壞死因子-α。①與LPS+si-NC組比較，P<0.05。②與LPS+si-BDNF-AS+anti-miR-NC組比較，P<0.05。

組別LPS+si-NC LPS+si-BDNF-AS LPS+si-BDNF-AS+anti-miR-NC LPS+si-BDNF-AS+anti-miR-495-3p F值P值重復次數3 3 3 3 Bax 0.30±0.03 0.68±0.06①0.71±0.07 0.39±0.04②138.55<0.001 Bcl-2蛋白0.63±0.06 0.28±0.03①0.26±0.03 0.54±0.05②157.18<0.001 miR-495-3p 1.00±0.06 2.85±0.27①2.89±0.28 1.46±0.15②189.15<0.001 IL-1β/（ng/L）531.41±49.87 141.65±14.33①135.67±13.54 486.33±41.25②362.02<0.001 TNF-α/（ng/L）1 265.33±129.47 365.41±32.45①358.33±30.48 986.37±74.21②308.07<0.001凋亡率/%37.54±3.71 12.65±1.24①11.58±1.19 29.48±2.81②239.28<0.001

3 討論

研究表明lncRNA在細胞炎癥、免疫等方面具有重要作用，在慢阻肺中異常表達的lncRNA與慢阻肺發病機制密切相關，有望成為慢阻肺發生、發展的早期生物學標志物及治療的潛在靶點［10］。研究報道抑制lncRNA BDNF-AS可挽救缺氧/復氧受損鼠心肌細胞的細胞死亡和凋亡［11］。抑制lncRNA BDNF-AS減弱了缺氧/復氧誘導的神經細胞凋亡［12］。沉默BDNF-AS增加了Aβ25-35誘導的PC12細胞的活力，并抑制細胞凋亡和氧化應激［13］，該實驗通過LPS誘導大鼠肺泡巨噬細胞的結果顯示，IL-1β、TNF-α、Bax增加，Bcl-2降低，細胞的凋亡表達增加，且BDNF-AS高表達，說明LPS可誘導大鼠肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應。該實驗進一步抑制BDNFAS表達，結果顯示IL-1β、TNF-α、Bax降低，Bcl-2升高，細胞凋亡表達降低，表示降低BDNF-AS對抑制LPS誘導的大鼠肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應具有一定作用，且研究報道慢阻肺大鼠外周血壓炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高［14］，提示BDNF-AS可能參與慢阻肺進展。

研究表明慢阻肺主要出現慢性炎癥反應，而miRNA與炎性疾病相關，參與慢阻肺的發生發展［15-16］。研究發現LPS誘導的牙周膜細胞中miR-495-3p下調表達［17］。miR-495-3p下調表達可能加劇LPS處理的RAW264.7細胞的炎癥反應［18］。miR-495-3p在缺血再灌注損傷小鼠模型和過氧化氫誘導的H9C2細胞損傷中表達降低，過表達miR-495-3p可抑制TNF-α、IL-1β和IL-18的表達［19］。該實驗結果顯示，LPS誘導的大鼠肺泡巨噬細胞中miR-495-3p也低表達，過表達miR-495-3p后，IL-1β、TNF-α、Bax降低，Bcl-2升高，細胞凋亡降低。表示miR-495-3p的過度反應對降低LPS誘導的大鼠肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應具有一定影響。且該實驗還發現BDNF-AS靶向調控miR-495-3p，抑制miR-495-3p表達逆轉了降低了炎性的抑制效能。說明lncRNA BDNF-AS對抑制大鼠肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應具有一定作用。

綜上所述，lncRNA BDNF-AS可通過miR-495-3p干預LPS誘導大鼠的肺泡巨噬細胞凋亡和炎癥反應。