長鏈非編碼RNA LINC00346調控微小RNA-138-5p對宮頸癌細胞增殖、凋亡的影響

忽平，王麗媛

宮頸癌是全球第四大常見的女性癌癥［1］，盡管診斷和治療手段不斷進步，但宮頸癌每年導致超過25萬人死亡［2］。其轉移性導致宮頸癌病人預后較差，反復治療導致耐藥性，因此發現宮頸癌新的治療靶點，可有效提高病人生存率和生存質量。

研究表明，多種長鏈非編碼RNA（long non-cod‐ing RNA，lncRNA）、微小RNA（micro RNA，miRNA/miR）在宮頸癌中表達異常，并通過lncRNA-miRNA的調控網絡調控癌癥的進展［3-4］。LINC00346在原發性肝癌組織和細胞株、胃癌和非小細胞肺癌中表達上調，促進癌細胞的生存、增殖、凋亡等過程，且與miR-138-5p存在結合位點［5-7］。miR-138-5p在宮頸癌中表達下調，可能通過Wnt/β-catenin信號通路促進宮頸癌的惡性進展［8］。然而LINC00346和miR-138-5p在宮頸癌中的關系尚未可知。本研究檢測宮頸癌組織中LINC00346的含量，并以宮頸癌（cer‐vical cancer）海拉細胞為研究對象，探討LINC00346和miR-138-5p對海拉細胞增殖、凋亡影響的分子機制，旨在為宮頸癌分子靶向治療提供新的參考。

1 材料與方法

1.1材料選取2018年1—12月于南陽市中心醫院手術治療的28例宮頸癌病人的宮頸癌組織及癌旁正常組織（距離宮頸癌組織邊緣>5 cm）為研究對象，年齡（50.32±13.12）歲，范圍為23～72歲，宮頸鱗癌23例，宮頸腺癌5例。所有病人術前未接受放療和化療。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，并且病人均簽署知情同意書。

人宮頸癌細胞株海拉細胞由中科院上海細胞庫提供；胎牛血清及RPMI-1640培養基由美國Hy‐clone公司生產，噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）及胰蛋白酶由美國Sigma-Aldrich公司生產；Tran‐swell板由美國Corning公司生產；引物、LINC00346干擾物（si-LINC00346）、miR-138-5p mimics（miR-138-5p）、miR-138-5p抑制物（anti-miR-138-5p）、陰性對照（si-NC、miR-NC和anti-miR-NC）由上海吉瑪制藥有限公司生產；凋亡檢測試劑盒由上海碧云天生物技術有限公司生產；Lipofectamine 2000轉染試劑由美國Invitrogen公司生產；雙熒光素酶報告系統（Dual-Luciferase Reporter Assay System）由美國Pro‐mega公司生產；Total RNA提取、Real-time PCR及逆轉錄試劑盒由寶生物工程（大連）有限公司生產；Re‐al-time PCR儀由美國Bio-Rad公司生產。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將宮頸癌細胞株海拉細胞接種在含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素及RPMI-1640培養基的培養液中，并于37℃5%二氧化碳培養箱中培養、傳代。

1.2.2細胞轉染 將對數生長期的海拉細胞應用上述細胞培養液稀釋至1×l06個/毫升，接種于6孔板中（濃度為2×103個/孔），并于細胞融合度達到80%時，嚴格遵循轉染試劑說明書進行轉染。將si-NC、si-LINC00346、miR-NC、miR-138-5p、si-LINC00346+anti-miR-NC、si-LINC00346+anti-miR-138-5p的載體分別轉染到培養好的海拉細胞孔板中。于轉染48 h后收集細胞，進行實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）驗證，確保無誤后進行后續相關實驗。

1.2.3qRT-PCR檢測LINC00346和miR-138-5p mRNA的表達 收集“1.2.2”中轉染驗證后的海拉細胞，依據RNA抽提試劑盒及逆轉錄試劑盒說明書要求提取總RNA，并快速將其逆轉錄為互補DNA（cDNA）。嚴格按照qRT-PCR的說明書合成LINC00346和miR-138-5p。LINC00346正向引物5′-CACCATGTTGGC‐CAGGCTGGT-3′，LINC00346反 向引物：5′-GGC‐CAAAGAGTGACCATCATC-3′；miR-138-5p正向引物：5’-GGAGCTGGTGTTGTGAATCA-3’，反向引物：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。用2?ΔΔCt進行數據分析。

1.2.4蛋白質印跡法檢測海拉細胞中周期素依賴激酶抑制劑p21（P21）和胱天蛋白酶-3（caspase-3）的蛋白含量 收集轉染驗證后的各組海拉細胞，RI‐PA蛋白裂解液提取細胞中總蛋白，取適量蛋白溶液，100℃煮沸10 min。蛋白變性后，以每孔30μg蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），用轉膜儀濕轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。轉膜后，用5%脫脂奶粉封膜2 h。分別加入P21和caspase-3一抗（P21：兔來源單克隆抗體，1∶1 000；caspase-3：兔來源單克隆抗體，1∶500），4℃孵育過夜。洗膜后，加入山羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶200），室溫孵育1 h。洗膜后，避光滴加ELC顯影液顯影，凝膠成像拍照。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.2.5MTT法測定細胞存活率 收集轉染驗證后的各組海拉細胞，于胰蛋白酶消化后，接種于96孔板中（2×103個/孔），培養48 h后每孔分別加入MTT溶液20μL，繼續培養4 h后，棄去上清培養液，并于每孔加入DMSO溶解結晶150μL，室溫條件下振蕩5 min，應用酶標儀測定490 nm處的吸光度。存活率（%）=實驗組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.2.6流式細胞術測定細胞凋亡 收集轉染后培養至對數生長期的各組海拉細胞，PBS清洗2遍，用RPMI-1640培養基稀釋細胞密度為1×105個/毫升。應用上流式細胞儀并嚴格按照凋亡檢測試劑盒說明書完成細胞凋亡率檢測。

1.2.7雙熒光素酶報告系統驗證LINC00346與miR-138-5p的靶向關系 根據“1.2.2”方法完成海拉細胞培養及轉染，將構建的LINC00346的野生型（WT-LINC00346）和突變型（MUT-LINC00346）雙熒光素酶報告載體，分別與miR-NC或miR-138-5p對海拉細胞進行共轉染，轉染48 h后裂解細胞，離心并收集上清，以海腎熒光素酶活性為內參，檢測并計算螢火蟲熒光素酶的相對活性。

1.3統計學方法應用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料用±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1LINC00346在宮頸癌組織中的表達qRTPCR結果表明，與正常癌旁組織相比，宮頸癌組織中LINC00346 mRNA含量顯著升高［（2.51±0.08）比（0.99±0.05），t=85.26，P<0.001］。

2.2敲除LINC00346對宮頸癌海拉細胞增殖和凋亡的影響轉染si-LINC00346后，與si-NC組相比，si-LINC00346組宮頸癌海拉細胞中的LINC00346含量顯著下降，P21和caspase-3蛋白含量升高，細胞存活率降低，凋亡率升高，均差異有統計學意義（P<0.05），見圖1和表1。說明敲除LINC00346可以抑制海拉細胞增殖并促進細胞凋亡。

表1 敲除LINC00346對宮頸癌海拉細胞增殖、凋亡的影響/±s

表1 敲除LINC00346對宮頸癌海拉細胞增殖、凋亡的影響/±s

注：P21為周期素依賴激酶抑制劑p21，caspase-3為胱天蛋白酶-3。

組別si-NC si-LINC00346 t值P值重復次數9 9 LINC00346 1.00±0.05 0.33±0.03 34.47<0.001存活率/%100.00±6.13 52.84±4.39 18.76<0.001凋亡率/%8.19±1.00 23.39±1.64 23.74<0.001 P21 0.22±0.02 0.63±0.04 27.50<0.001 caspase-3 0.30±0.03 0.79±0.05 25.21<0.001

圖1 敲除LINC00346對宮頸癌海拉細胞P21、caspase-3蛋白表達的影響

2.3LINC00346靶向調控miR-138-5pTargetscan預測結果顯示，LINC00346的序列中含有與mi R-138-5p互補的位點，見圖2。雙熒光素酶報告系統結果顯示，與miR-NC對照組相比，miR-138-5p組野生型WT-LINC00346的海拉細胞的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降［（0.24±0.03）比（0.97±0.05）］（t=37.56，P<0.001）；而突變型MUT-LINC00346的海拉細胞的螢火蟲熒光素酶相對活性沒有明顯變化［（0.98±0.05）比（0.99±0.05）］（t=0.42，P=0.677）。說明LINC00346靶向結合miR-138-5p。qRT-PCR結果顯示，敲除LINC00346可顯著上調miR-138-5p含量［（2.43±0.07）比（1.01±0.05）］（t=49.52，P<0.001）。說明LINC00346靶向負調控miR-138-5p表達。

圖2 LINC00346靶向miR-138-5p

2.4轉染miR-138-5p對海拉細胞增殖、凋亡的影響轉染miR-138-5p后，與miR-NC組相比，miR-138-5p組海拉細胞中miR-138-5p含量升高，細胞存活率降低，凋亡率升高，P21和caspase-3蛋白含量升高，差異有統計學意義（P<0.001），見圖3和表2。

表2 轉染miR-138-5p對宮頸癌海拉細胞增殖、凋亡的影響/±s

表2 轉染miR-138-5p對宮頸癌海拉細胞增殖、凋亡的影響/±s

注：P21為周期素依賴激酶抑制劑p21，caspase-3為胱天蛋白酶-3。

組別miR-NC miR-138-5p t值P值重復次數9 9 miR-138-5p 1.00±0.04 2.88±0.06 78.21<0.001存活率/%100.03±6.04 63.88±4.92 13.92<0.001凋亡率/%8.15±0.98 19.64±1.35 20.66<0.001 P21 0.21±0.02 0.54±0.04 22.14<0.001 caspase-3 0.29±0.03 0.67±0.04 22.80<0.001

圖3 miR-138-5p對宮頸癌海拉細胞凋亡及P21、caspase-3蛋白表達的影響

2.5下調miR-138-5p能逆轉敲除LINC00346對海拉細胞增殖和凋亡的影響為明確LINC00346通過調控miR-138-5p影響海拉細胞的增殖、凋亡，我們同時敲除LINC00346和下調miR-138-5p，結果顯示，與si-LINC00346+anti-miR-NC組相比，si-LINC00346+antimiR-138-5p組miR-138-5p含量降低，細胞存活率升高，凋亡細胞數升高，P21和caspase-3蛋白含量降低，均差異有統計學意義（均P<0.001），見表3。說明下調miR-138-5p可逆轉敲除LINC00346對海拉細胞增殖和凋亡的作用。

表3 下調miR-138-5p和敲除LINC00346對宮頸癌海拉細胞增殖、凋亡的影響/±s

表3 下調miR-138-5p和敲除LINC00346對宮頸癌海拉細胞增殖、凋亡的影響/±s

注：P21為周期素依賴激酶抑制劑p21，caspase-3為胱天蛋白酶-3。

組別si-LINC00346+anti-miR-NC si-LINC00346+anti-miR-138-5p t值P值重復次數9 9 miR-138-5p 1.02±0.05 0.30±0.03 37.04<0.001存活率/%52.79±4.35 88.29±5.32 15.50<0.001凋亡率/%23.41±1.65 11.91±1.37 16.09<0.001 P21 0.62±0.04 0.28±0.03 20.40<0.001 caspase-3 0.77±0.05 0.38±0.04 18.27<0.001

3 討論

宮頸癌中異常表達的lncRNAs通過抑制或促進腫瘤發展，在宮頸癌的預后、腫瘤進展、侵襲轉移、細胞凋亡和抗放射治療中發揮調控作用［9-10］。

lncRNA LINC00346在多種癌癥中表達異常，與癌癥的進展和耐藥性有關。LINC00346在膀胱癌組織中的表達顯著上調，LINC00346基因敲除可抑制膀胱癌細胞增殖和遷移，誘導細胞周期阻滯和凋亡［11］。LINC00346在 胰 腺 癌 中 也 高 表 達，敲 除LINC00346抑制胰腺癌細胞增殖，導致細胞周期阻滯在G2/M期；在體外和體內，LINC00346的缺失也增強了胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性［12］。LINC00346在乳腺癌癌中過表達，與總體低生存率相關，可能是預后標志物［13］。但尚未有研究闡述LINC00346是否影響宮頸癌細胞的增殖、凋亡。本研究發現，與正常癌旁組織相比，LINC00346在宮頸癌組織中含量也顯著升高，敲除LINC00346可以抑制海拉細胞存活率，提高細胞凋亡率及P21和caspase-3蛋白含量。說明LINC00346參與調控宮頸癌細胞的增殖和凋亡。

本研究通過TargetScan預測發現，miR-138-5p與LINC00346序列中存在可結合位點，兩者可能存在結合關系。miR-138-5p在膠質瘤［14］、胰腺癌［15］、肺腺癌［16］、結直腸癌［17］和膀胱癌［18］等多種癌癥中表達下調，調節膠質瘤的血管生成，過表達miR-138-5p通過靶向沉默信息調節因子2相關酶1（SIRT1）抑制胰腺癌的自噬和腫瘤生長，抑制肺腺癌的細胞的上皮-間充質轉化（EMT）、增殖和轉移，也可靶向人端粒酶逆轉錄酶基因（hTERT）抑制結直腸癌。miR-138-5p在宮頸癌中也表達下調，miR-138-5p的表達降低與宮頸癌病人的FIGO分期晚期、分化不良、淋巴結轉移和總體生存率低下有關，miR-138-5p的過度表達可以通過靶向SIRT1抑制細胞增殖，阻滯G0/G1期細胞，誘導細胞凋亡［19］。本研究通過雙熒光素酶報告系統發現，LINC00346靶向結合miR-138-5p，且下調LINC00346可上調miR-138-5p表達。進一步研究表明，過表達miR-138-5p可抑制細胞存活誘導細胞凋亡，下調miR-138-5p表達可逆轉敲減LINC00346對海拉細胞增殖和凋亡的作用，間接說明LINC00346靶向miR-138-5p在海拉細胞的增殖凋亡中發揮調節作用。

綜上，本研究明確了lncRNA LINC00346在宮頸癌組織中表達上調，在宮頸癌海拉細胞中lncRNA LINC00346靶向miR-138-5p調控宮頸癌海拉細胞增殖和凋亡。lncRNA LINC00346可能是宮頸癌潛在的分子靶點。