養(yǎng)血清腦顆粒治療血管性癡呆大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

趙永艷，劉瑩瑩，吳勝英

血管性癡呆主要繼發(fā)于缺血性腦血管病，根據(jù)病因、病變腦組織的部位、起病的形式可分為急性血管性癡呆、亞急性或慢性血管性癡呆［1］。血栓脫落引起的栓塞、血液動(dòng)力學(xué)改變或任何可導(dǎo)致頸動(dòng)脈與椎-基底動(dòng)脈供血不足均可造成大腦行為、記憶及認(rèn)知功能區(qū)低灌注，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧并最終使大腦功能全面衰退，造成血管性認(rèn)知損害，表現(xiàn)為包括記憶、認(rèn)知、情緒、行為等癥狀與體征改變的綜合征，且這種獲得性智能損害常持續(xù)數(shù)月或半年以上［2-3］。血管性癡呆與年齡增長(zhǎng)呈正相關(guān)，故積極探討其發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療藥物和方法意義重大。養(yǎng)血清腦顆粒具有活血通絡(luò)、滋陰養(yǎng)血、平肝潛陽之功效，在臨床治療血管性癡呆等已有應(yīng)用，可顯著改善患者記憶、認(rèn)知、情緒和行為能力［4］。目前有研究證實(shí)其主要通過增高5-羥色胺、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)生長(zhǎng)因子蛋白含量來改善臨床癥狀［5-6］。但對(duì)反映疾病嚴(yán)重程度的血清S100B蛋白（S100B）和及腦功能恢復(fù)密切相關(guān)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）及β-連環(huán)素（β-catenin）的表達(dá)缺少相關(guān)研究。本研究起止時(shí)間為2019年2—6月，采用兩血管阻斷法制作大鼠血管性癡呆模型，每日用養(yǎng)血清腦顆粒灌胃治療，觀察其對(duì)腦海馬CA1區(qū)VEGF、β-catenin和GFAP蛋白表達(dá)的影響，借此探討可能機(jī)理，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠36只，雄性，體質(zhì)量范圍為165～175 g，購自湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心，飼養(yǎng)于十堰市太和醫(yī)院科研中心標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（鄂）2016-0008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（鄂）2016-031。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則，實(shí)驗(yàn)遵守3R原則，滿足動(dòng)物福利。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)室濕度60%～75%，室溫（22±2）℃，12 h/12 h明暗交替光照。

1.2儀器和試劑高效液相色譜儀購自上海彬合物資有限公司（UltiMate 3000型）；水合氯醛購自武漢博萊特化工有限公司；養(yǎng)血清腦顆粒購自天津天士力制藥股份有限公司（批號(hào)0170822）；VEGF和S100BELISA試劑盒由上海仁捷生物科技有限公司提供；兔抗大鼠β-catenin多克隆抗體由北京博奧森生物公司提供；DAB和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白顯色液由北京中杉生物有限公司提供；5-羥色胺標(biāo)準(zhǔn)品購自Aladdin；色譜純乙腈、甲醇、甲酸（Thermo Fisher Scientific）；ELISA試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.3血管性癡呆模型制備及納入標(biāo)準(zhǔn)模型制備參照劉偉等［7］兩血管阻斷法建模：造模前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將其中24只于手術(shù)前用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，待動(dòng)物麻醉后，仰臥位固定四肢和頭部，剪去頸部鼠毛并消毒，切開頸部皮膚，分離雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，后用動(dòng)脈夾將大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉10min后再通10 min，反復(fù)3次即可縫合傷口［7］。納入標(biāo)準(zhǔn)：大鼠術(shù)后2 h左右會(huì)清醒，以行走向一側(cè)傾倒、轉(zhuǎn)圈，靜止和提尾時(shí)向一側(cè)前肢蜷曲，Zea Longa神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分［8］在1～4分之間為入選標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)分為0和5分的棄去。本實(shí)驗(yàn)無動(dòng)物死亡，24只均成模。

1.4分組及治療方法先將養(yǎng)血清腦顆粒配制成6.4%的混懸液備用。然后將經(jīng)以上兩血管阻斷法制作的24只血管性癡呆模型采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和實(shí)驗(yàn)組（n=12），另12只未手術(shù)的設(shè)為對(duì)照組，對(duì)照組不進(jìn)行建模手術(shù)。實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后1周時(shí)皮膚均愈合，每天按20 mL·kg?1·d?1劑量，分2次灌胃給予6.4%的養(yǎng)血清腦顆粒混懸液，治療3周，模型組和對(duì)照組灌等體積生理鹽水對(duì)照，模型組和對(duì)照組灌等體積生理鹽水對(duì)照。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 治療3周后用WMT-100型Morris水迷宮分析系統(tǒng)進(jìn)行定位航行試驗(yàn)測(cè)試逃避潛伏期，空間探索實(shí)驗(yàn)測(cè)試60 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)，結(jié)合Zea Longa神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分評(píng)定大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。

1.5.2血清S100B檢測(cè)方法 治療3周后，分別斷尾，取0.2 mL尾靜脈血備用，采用免疫吸附法檢測(cè)靜脈血清S100B蛋白含量。

1.5.35-羥色胺檢測(cè)方法 檢測(cè)前配制人工腦脊液（氯化鈉7.247 g，氯化鉀0.224 g，氯化鈣0.222 g，硫酸鎂0.493 g，碳酸氫鈉2.184 g，葡萄糖0.6 g，磷酸二氫鈉0.193 g，溶于蒸餾水1 000 mL），通95%氧氣+5%二氧化碳飽和后置于4℃冰箱備用。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠斷頭處死，迅速分離出腦組織，放入人工腦脊液中，小心分離出海馬CA1區(qū)組織凍存。檢測(cè)時(shí)取出，室溫解凍，取200μL水與甲醇混合液（比例為1∶1），將標(biāo)本放入、振蕩、勻漿、瞬離，抽取組織勻漿上清液100μL于離心管，加入200μL乙腈后渦旋（5 min），高速離心5 min（4℃，14 000 r/min），取上清加樣檢測(cè)，采用高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（HPLC-MS）法檢測(cè)腦組織海馬CA1區(qū)組織中5-羥色胺含量。

1.5.4免疫組化 取凍存腦組織，石蠟包埋，切片，烤干，脫蠟，采用ELISA放射免疫方法檢測(cè)腦組織VEGF含量；切片經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后檢測(cè)GFAP和β-catenin蛋白陽性表達(dá)。免疫組化方法嚴(yán)格按試劑說明書具體操作步驟按進(jìn)行。GFAP和βcatenin蛋白免疫組化陽性標(biāo)準(zhǔn)：光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞胞漿和胞核均呈棕黃色。組織切片采用攝像顯微鏡攝像，選擇各組大鼠海馬CA1區(qū)不重疊的6個(gè)視野，應(yīng)用數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分別進(jìn)行GFAP和β-catenin陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以±s表示計(jì)量資料，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。因Zea Longa評(píng)分和VEGF不滿足方差齊性假設(shè)，多組間兩兩比較采用非齊性條件下的Games-Howell檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠空間探索試驗(yàn)、定位航行及ZeaLonga評(píng)分比較除Zea Longa評(píng)分不滿足方差齊性分析外，其他檢測(cè)值均滿足方差齊性。其中在Morris水迷宮空間探索試驗(yàn)中，模型組大鼠在撤去平臺(tái)60 s時(shí)間內(nèi)跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在定位航行試驗(yàn)中，模型組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，Zea Longa行為學(xué)評(píng)分分值提高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠則相反，其60 s時(shí)間內(nèi)跨越平臺(tái)次數(shù)明顯增多、逃避潛伏期明顯縮短，Zea Longa評(píng)分較模型組明顯降低，與模型組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。因Zea Longa評(píng)分不滿足方差齊性假設(shè)，采用非齊性條件下的Games-Howell檢驗(yàn)，結(jié)果顯示任意兩組之間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 大鼠空間探索試驗(yàn)、定位航行及Zea Longa神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較/±s

表1 大鼠空間探索試驗(yàn)、定位航行及Zea Longa神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較/±s

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組模型組實(shí)驗(yàn)組F值P值鼠數(shù)12 12 12穿臺(tái)次數(shù)/次6.05±0.27 2.92±0.14①5.75±0.39①②440.38<0.001逃避潛伏期/s 41.24±3.49 86.95±6.34①42.57±3.20①②388.56<0.001 Zea Longa/分0.04±0.00 3.84±0.31①1.91±0.21①②904.13<0.001

2.2大鼠所測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)比較除CA1區(qū)VEGF不滿足方差齊性外，其他檢測(cè)值均滿足方差齊性。其中模型組血清S100B及腦海馬CA1區(qū)GFAP蛋白表達(dá)均增多、腦海馬CA1區(qū)5-羥色胺含量降低，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），腦海馬CA1區(qū)VEGF、β-catenin蛋白表達(dá)增多，但與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而治療后實(shí)驗(yàn)組S100B和GFAP蛋白明顯降低，5-羥色胺含量及CA1區(qū)VEGF和β-catenin蛋白表達(dá)均增多，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。因CA1區(qū)VEGF不滿足方差齊性假設(shè)，采用非齊性條件下的Games-Howell檢驗(yàn)，結(jié)果顯示對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組、模型組與實(shí)驗(yàn)組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），對(duì)照組與模型組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 大鼠各項(xiàng)指標(biāo)比較/±s

表2 大鼠各項(xiàng)指標(biāo)比較/±s

注：S100B為血清S100B蛋白，GFAP為膠質(zhì)纖維酸性蛋白，β-catenin為β-連環(huán)素，VEGF為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組模型組實(shí)驗(yàn)組F值P值鼠數(shù)12 12 12 S100B/（mg/L）2.41±0.21 5.29±0.37①2.85±0.34①②297.22<0.001 5-羥色胺/（μg/L）0.74±0.09 0.51±0.05①0.73±0.09②33.03<0.001 GFAP/（個(gè)/高倍視野）10.84±0.89 35.53±2.18①21.45±1.49①②712.27<0.001 β-catenin/（個(gè)/高倍視野）9.97±1.09 10.08±1.20 12.40±1.56①②13.37<0.001 VEGF/（mg/L）150.59±7.53 151.82±7.35 193.25±16.34①②56.19<0.001

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，血管性癡呆與神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺、多巴胺等有關(guān)，因其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)高級(jí)神經(jīng)功能具有重要調(diào)節(jié)作用，其在神經(jīng)元含量下降可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙［9］。在本實(shí)驗(yàn)中模型組腦海馬CA1區(qū)5-羥色胺含量低于對(duì)照組，大鼠平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，跨越平臺(tái)次數(shù)減少，Zea Longa評(píng)分也明顯高于對(duì)照組。這一方面提示血管性癡呆建模成功，同時(shí)也證實(shí)腦海馬CA1區(qū)5-羥色胺含量降低影響到學(xué)習(xí)記憶功能。有研究表明，腦組織缺血與血管性癡呆的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，腦組織缺血低氧性低灌注會(huì)直接或間接損傷海馬區(qū)神經(jīng)元，引起腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷甚至突觸丟失，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能障礙［10］。Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與神經(jīng)元的發(fā)育，而β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞核內(nèi)靶基因的表達(dá)［11］。血管新生對(duì)腦損傷修復(fù)起到促進(jìn)作用，而VEGF是促進(jìn)血管新生的主要調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)受損血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，從而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、修復(fù)受損神經(jīng)元［12］。因此，通過干預(yù)β-catenin和VEGF等調(diào)節(jié)因子可能影響血管性癡呆病理過程。本實(shí)驗(yàn)中模型組腦海馬CA1區(qū)VEGF和β-catenin蛋白表達(dá)均低于正常對(duì)照組，說明夾閉大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈造成腦組織缺血而導(dǎo)致腦損傷，進(jìn)而導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙。而治療后，實(shí)驗(yàn)組CA1區(qū)VEGF和β-catenin蛋白表達(dá)均增多，提示養(yǎng)血清腦顆粒能誘導(dǎo)血管性癡呆模型大鼠VEGF和β-catenin的表達(dá)。S100B蛋白主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的樹突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞，大量臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腦卒中患者血清S100B蛋白濃度明顯提高，而高濃度的S100B參與神經(jīng)退化的過程，產(chǎn)生的神經(jīng)毒性作用可導(dǎo)致腦組織對(duì)缺血缺氧的敏感性增加，加劇神經(jīng)元損傷及凋亡的風(fēng)險(xiǎn)，而經(jīng)治療后S100B蛋白則顯著下降，說明S100B蛋白濃度變化與癡呆患者病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［13］。另外，血管性癡呆與星形膠質(zhì)細(xì)胞功能有關(guān)，而GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)志物，故其在腦組織中表達(dá)可直接反映星形膠質(zhì)細(xì)胞活化與增生狀況［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組血清S100B及腦海馬CA1區(qū)GFAP蛋白表達(dá)均增多，學(xué)習(xí)記憶能力的降低（大鼠平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，跨越平臺(tái)次數(shù)減少，Zea Longa評(píng)分也明顯高于對(duì)照組）；而治療后實(shí)驗(yàn)組S100B和GFAP蛋白明顯降低，這一結(jié)果與董靜等［14］研究結(jié)果高度一致，這可能是養(yǎng)血清腦顆粒通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、增生而發(fā)揮其對(duì)血管性癡呆的治療效應(yīng)。

中醫(yī)學(xué)將血管性癡呆歸屬“癡證、善忘、不慧、愚癡、神呆”之范疇，表現(xiàn)為與智力有關(guān)的腦功能全面衰退為主的綜合癥候群［15］。現(xiàn)代中醫(yī)將血管性癡呆分為腎虛髓虧、肝腎陰虛、瘀阻清竅、痰蒙清竅、心肝火旺、氣虛血瘀、心脾兩虛等七種基本證型，其中以腎虛髓虧貫穿整個(gè)血管性癡呆病程，其他證型兼并存在［16］。本研究認(rèn)為，血管性癡呆具有本虛邪實(shí)的特點(diǎn)，病位以腎為主，其次為腦竅及心肝脾；病性以髓虧陰虛、氣虛為主；病因以瘀血、痰濁為主。因腎主藏精生髓，腎精充盈則髓海得養(yǎng)，使人聰穎智慧；腦府失養(yǎng)、腎虛髓空則神情呆滯、反應(yīng)遲鈍而愚癡，因此，在治療時(shí)應(yīng)根據(jù)辨證分型有針對(duì)性地治療。如腎虛髓虧者可益腦填髓、補(bǔ)益肝腎；氣滯血瘀者可行氣活血、化瘀開竅；氣虛血瘀者當(dāng)補(bǔ)氣活血、通絡(luò)開竅；心脾兩虛者當(dāng)健脾養(yǎng)心、開竅醒神；痰濁阻絡(luò)者當(dāng)健脾化痰、活血通絡(luò)；腎陽虛衰型當(dāng)溫腎運(yùn)脾、健腦醒神等，總之，血管性癡呆治療宜以清熱祛瘀、化痰開竅、益肝腎為總的治療原則［17］。

“養(yǎng)血清腦顆粒”是以中醫(yī)名方“四物湯”改良研制的復(fù)方中藥制劑，由當(dāng)歸、川芎、白芍、夏枯草、鉤藤、決明子、熟地黃、雞血藤、珍珠母、細(xì)辛、延胡索等多味中藥組成［18］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，養(yǎng)血清腦顆粒可顯著改善血管性癡呆大鼠腦皮層微循環(huán)、增加癡呆大鼠腦血管血流量、抑制腦細(xì)胞凋亡、減輕缺血缺氧造成的缺血性腦損傷，明顯改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力［19］，本研究結(jié)果與其相符。養(yǎng)血清腦顆粒還可調(diào)節(jié)腦卒中大鼠血清中神經(jīng)因子的含量，從而改善神經(jīng)元的損害癥狀［20］。養(yǎng)血清腦顆粒具有補(bǔ)虛祛邪、活血養(yǎng)血、平肝潛陽、標(biāo)本兼治的藥理特性，可調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺及多巴胺合成，還可松弛動(dòng)脈平滑肌、擴(kuò)張全身小動(dòng)脈、降低腦血管阻力并改善腦血流狀態(tài)，從而發(fā)揮降低神經(jīng)功能缺損程度的作用，在治療癡呆方面取得了一定的臨床療效［21-22］。從中醫(yī)藥理角度分析，養(yǎng)血清腦顆粒具有補(bǔ)益肝腎、益腦填髓的作用。方中當(dāng)歸具活血化瘀通絡(luò)之功效，川芎主要成分川芎嗪和阿魏酸具行血中元?dú)狻⑸菩杏陬^面的藥效，二者均具有擴(kuò)張血管、抗血小板聚集及改善微循環(huán)的作用；白芍主要成分白芍總苷具有抗血栓形成、抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等作用；另外，熟地黃補(bǔ)腎養(yǎng)血滋陰；珍珠母、決明子可平肝熄風(fēng)止痙。雞血藤可補(bǔ)肝腎、益精壯陽，具有促進(jìn)造血功能、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)靜催眠等藥理作用；珍珠母主平肝潛陽、安神、定驚明目；夏枯草清熱瀉火、明目，可散結(jié)消腫；細(xì)辛解表散寒、祛風(fēng)止痛、通竅、溫肺化飲；延胡索活血、利氣、止痛，可行血中氣滯、氣中血滯。以上諸藥組成養(yǎng)血清腦顆粒方劑，在治療血管性癡呆上可起到補(bǔ)虛祛邪、養(yǎng)血滋陰、補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)、平肝潛陽、益腦填髓的作用，使腦竅得以保養(yǎng)，學(xué)習(xí)記憶能力提高，智力和運(yùn)動(dòng)功能得以部分恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)組60 s時(shí)間內(nèi)跨越平臺(tái)次數(shù)明顯增多、逃避潛伏期明顯縮短，Zea Longa評(píng)分較模型組明顯降低，證實(shí)經(jīng)養(yǎng)血清腦顆粒治療，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力提高。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從血管活性物質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)和行為學(xué)等方面入手，結(jié)合養(yǎng)血清腦顆粒方劑中藥藥理作用，全面考察了養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)血管性癡呆大鼠的治療作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，養(yǎng)血清腦顆粒可能通過上調(diào)β-catenin蛋白、促進(jìn)VEGF和5-羥色胺合成、降低GFAP、改善腦組織血流狀態(tài)來發(fā)揮對(duì)血管性癡呆的治療作用。