中藥材蛇莓標(biāo)準(zhǔn)關(guān)鍵控制指標(biāo)研究

金鳳華，程慶兵，劉業(yè)飛，葉紅兵，葉玲

中藥蛇莓為薔薇科（Rosaceae）蛇莓屬（Duch‐esnea）植物蛇莓Duchesnea indica（Andr.）Focke的干燥全草。蛇莓始載于《名醫(yī)別錄》，為民間常用中草藥，《中國藥典》2020年版四部“成方制劑中本版藥典未收載的藥材和飲片”中有蛇莓的來源和名稱描述［1］。研究表明，蛇莓的主要化學(xué)成分為甾醇類、糖苷類、萜類、黃酮類等，主要應(yīng)用于降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等藥理作用［2-7］。三萜類化合物齊墩果酸和熊果酸結(jié)構(gòu)相似，性質(zhì)相近，試驗表明在一般薄層色譜方法中難以分離。該研究在前期對蛇莓三萜類成分做了大量試驗研究，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［8-10］，采用相應(yīng)的薄層分離條件，對蛇莓中的三萜類成分進(jìn)行了薄層色譜鑒別研究。文獻(xiàn)［11-19］報道，鞣花酸是蛇莓藥材中含量較高的成分之一，且鞣花酸具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等藥理作用。課題組查閱《中國植物志》《中華本草》《中藥大辭典》及近現(xiàn)代藥材標(biāo)準(zhǔn)，均有收載蛇莓，但檢驗項目單一、檢驗內(nèi)容簡單，均未收載蛇莓質(zhì)量控制關(guān)鍵性指標(biāo)的檢驗項目，為提升蛇莓的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，課題組收集10批蛇莓中藥材（由安徽省食品藥品檢驗研究院提供），于2020年11月至2021年8月對中藥材蛇莓質(zhì)量控制的關(guān)鍵性指標(biāo)分別用薄層色譜法進(jìn)行定性考察及高效液相色譜法進(jìn)行定量分析，為完善和提升蛇莓藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)有力的研究依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器XPE205型電子天平（Mettler-Toledo），TUBE MILL CS025型粉碎機(jī)（IKA），TLCVISUALIZ‐ER2型薄層成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG公司），CAMAGLinomat-5型半自動點(diǎn)樣儀（瑞士CAMAG公司），ADC-2自動展開儀（瑞士CAMAG公司）。S120H型超聲波清洗器（德國ELMA公司），Milli-QAdvantage A10型超純水機(jī)（MILLIPORE）；U-3000型高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器（美國Thermo Fisher Sci‐entific公司）。

1.3樣品蛇莓藥材分別從福建、廣東、安徽等藥材市場收集共10批（安徽省食品藥品檢驗研究院提供，樣品編號Y1～Y10），經(jīng)合肥市食品藥品檢驗中心主任中藥師劉業(yè)飛鑒定為薔薇科（Rosaceae）植物蛇莓Duchesneaindica（Andr.）Focke的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1薄層色譜分析

2.1.1對照品溶液的配制 取齊墩果酸、熊果酸對照品，分別加無水乙醇制成0.2 g/L的溶液。

2.1.2供試品溶液的制備 精密稱取不同產(chǎn)地蛇莓粉末2 g于50 mL錐形瓶中，加三氯甲烷20 mL。超聲提取30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加甲醇-三氯甲烷（1∶3）的混合溶液1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.3蛇莓藥材薄層色譜分析 （1）點(diǎn)樣：取蛇莓供試品溶液、齊墩果酸對照品溶液、熊果酸對照品溶液各2μL，點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上。（2）展開：點(diǎn)樣后浸入1%碘-二氯甲烷溶液［5］中，至過起始線迅速取出，立即用玻璃板履蓋，30 min后取下玻璃板，揮去薄層板上殘留的溶液。以環(huán)己烷-丙酮-醋酸乙酯-甲酸（9∶2∶3∶0.2）為展開劑，展開。（3）顯色：取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。觀察：分別置紫外光燈光（365 nm）和日光下檢視。（4）圖譜分析：薄層色譜圖見圖1。由圖可知，蛇莓供試品色譜與熊果酸對照品色譜在對應(yīng)位置顯示相同的顏色斑點(diǎn)，在與齊墩果酸對照品色譜對應(yīng)的位置上，無明顯的相同顏色斑點(diǎn)。

2.1.4薄層色譜方法學(xué)驗證

2.1.4.1溶劑優(yōu)化試驗 分別考察三氯甲烷、甲醇、無水乙醇3種溶劑的超聲提取效率。取蛇莓藥材Y4供試品溶液、齊墩果酸對照品溶液、熊果酸對照品溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上（經(jīng)1%碘－二氯甲烷溶液預(yù)處理），以環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸（9∶2∶3∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。置紫外光燈（365 nm）下檢視。可知，采用溶劑三氯甲烷超聲提取效果更佳。

這里 s表示向量，其第i個元素為 si，i=1,2,...,n是個常數(shù)。而對稱矩陣B稱為模塊度矩陣，其元素為：

2.1.4.2專屬性試驗 取齊墩果酸和熊果酸對照品溶液，按（1∶1）比例混合，加無水乙醇制成含齊墩果酸0.1 g/L、熊果酸0.1 g/L的混合溶液。取蛇莓Y4供試品溶液、齊墩果酸對照品溶液、熊果酸對照品溶液、齊墩果酸熊果酸混合對照品溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上（未經(jīng)1%碘－二氯甲烷溶液預(yù)處理）；另同法操作，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上（經(jīng)1%碘－二氯甲烷溶液預(yù)處理），以環(huán)己烷-丙酮-醋酸乙酯-甲酸（9∶2∶3∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。分別置日光和紫外光燈光（365 nm）下檢視，可知，未經(jīng)1%碘－二氯甲烷溶液預(yù)處理的薄層板，齊墩果酸、熊果酸為混合斑點(diǎn)，不能得到有效分離。經(jīng)1%碘－二氯甲烷溶液預(yù)處理，齊墩果酸對照品和熊果酸對照品能得到有效分離，斑點(diǎn)清晰可辨。

2.1.4.3穩(wěn)定性試驗 將“2.1.1”和“2.1.2”項下的熊果酸對照品溶液和供試品溶液放置24 h，按2.1.3操作，分別點(diǎn)樣于三個生廠商（默克化工技術(shù)有限公司，青島海洋化工廠分廠，青島邦凱高新技術(shù)材料有限公司）的硅膠G薄層板。實驗結(jié)果表明，該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，在不同廠家生產(chǎn)的硅膠G薄層板上色譜斑點(diǎn)重現(xiàn)性良好。

2.2鞣花酸含量測定

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取鞣花酸對照品約13 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述溶液5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取不同產(chǎn)地蛇莓藥材粉末（過四號篩）0.2 g，置100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱重，回流提取60 min，取出放置室溫時，再次稱重，補(bǔ)足甲醇重量，搖勻，用0.45μm微孔有機(jī)濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗 色譜柱：依利特C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序如下：0～5 min，10%～17%A；5～15 min，17%A；15～35 min，17%～25%A；35～40 min，10%A；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按鞣花酸計不小于6 000。

2.2.4方法學(xué)試驗

2.2.4.1線性范圍考察 分別精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液2.0、5.0、8.0、10.0、15.0、20.0μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件依法測定峰面積積分值，分別為2.880 7、6.950 8、11.035 5、13.799 0、20.631 6、27.387 6，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：A=1.363V+0.149，r=1.0（n=6）。實 驗表明：濃度 為12.289 9 mg/L的鞣花酸，在所試進(jìn)樣體積2.0～20.0μL范圍內(nèi)與峰面積積分值具有良好的線性關(guān)系。

2.2.4.2精密度試驗 精密吸取上述對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，按照上述色譜條件測定其峰面積積分值，其相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）=0.3%，表明儀器精密度較好。

2.2.4.3重復(fù)性試驗 精密稱取同一蛇莓樣品（Y2）供試品溶液5份，每份0.2 g，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定鞣花酸含量，其峰面積測量值的RSD=0.3%（應(yīng)≤2.0%），表明方法重復(fù)性較好。

2.2.4.4穩(wěn)定性試驗 分別吸取上述Y2供試品溶液10μL，配置后立即注入液相色譜儀，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，測定鞣花酸含量，考察其峰面積RSD為0.19%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.5準(zhǔn)確度試驗 精密稱取同一蛇莓樣品（Y2）6份，每份稱取0.1 g，至100 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品溶液25 mL，精密加入甲醇25 mL，精密稱定，回流提取60 min，取出放置室溫時再次稱重，補(bǔ)足甲醇重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，按“2.2.3”項下色譜條件測定鞣花酸含量，計算平均回收率為99.21%，RSD為1.8%。

2.2.4.6樣品測定結(jié)果 精密稱取上述10批蛇莓樣品各兩份，每份0.2 g，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定鞣花酸含量，測定了10批樣品中鞣花酸的含量，結(jié)果見表1。

參照《安徽省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》起草工作技術(shù)指引要求，設(shè)定含量測定限度公式如下：

式中μ為含量測定限值，xˉ為蛇莓樣本平均數(shù)，t為置信水平為99%的檢驗值，s為樣本的標(biāo)準(zhǔn)偏差，n為樣本批數(shù)，MU為不確定度。

從表1可以看出收集到的樣品含量差異較大，為了保證藥材質(zhì)量，結(jié)合限度計算公式，擬定含量測定限值為2.0 mg/g。

表1 蛇莓樣品中鞣花酸含量測定結(jié)果值

3 討論

3.1定性鑒別與分析課題組在薄層色譜鑒別實驗中，比較了三氯甲烷、無水乙醇、甲醇3種溶劑的提取效果，發(fā)現(xiàn)以三氯甲烷為溶劑，超聲提取的樣品成分多且相應(yīng)薄層色譜的斑點(diǎn)清晰；采用了多種展開劑如二甲苯-丙酮-乙醇-氨水（50∶50∶10∶1）氨水預(yù)飽和、環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（10∶3∶0.5）、環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸（9∶2∶1∶0.2）等，經(jīng)試驗論證環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸（9∶2∶3∶0.2）展開效果較好。因熊果酸和齊墩果酸為同分異構(gòu)體，且常同存在于同一藥材中，一般的薄層色譜方法不能將二者分離。有報道稱蛇莓藥材薄層色譜中，與齊墩果酸對照品相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)，經(jīng)課題組試驗發(fā)現(xiàn)，蛇莓藥材薄層色譜中，若不用1%碘－二氯甲烷溶液預(yù)處理，在與齊墩果酸對照品斑點(diǎn)相應(yīng)的位置上，確實顯示相同顏色的“斑點(diǎn)”，其實該“斑點(diǎn)”實為熊果酸與齊墩果酸的混合斑點(diǎn)，用1%碘－二氯甲烷溶液預(yù)處理后，熊果酸與齊墩果酸分離，從薄層色譜圖中可見，蛇莓是與熊果酸對照品相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)，而非齊墩果酸。該發(fā)現(xiàn)對鑒別蛇莓藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣意義重大。

3.2含量測定探討與研究課題組在溶解鞣花酸對照品時，發(fā)現(xiàn)鞣花酸在乙醇、低濃度甲醇中的溶解度較低，可在甲醇中溶解。樣品提取時選用了95%乙醇、三氯甲烷、甲醇3種溶劑進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鞣花酸在甲醇中提取效果最佳；課題組查閱相關(guān)文獻(xiàn)［20］，結(jié)合試驗摸索，采用了兩種提取方式—加熱回流、超聲，結(jié)果表明，回流提取效果較好；加熱回流時間是經(jīng)相同實驗條件下分別采用0.5 h、1.0 h、1.5 h等多個時間點(diǎn)回流提取確定的，試驗發(fā)現(xiàn)回流提取1.0 h效率最高。這10批蛇莓藥材分別產(chǎn)于安徽、廣東、遼寧等地，各地所產(chǎn)蛇莓中鞣花酸含量差別甚大，最大含量與最小含量約相差6倍，不同產(chǎn)地蛇莓主成分含量的研究，對蛇莓藥材種植基地的選取有指導(dǎo)性意義。