少見諾卡菌MALDI-TOF MS鑒定結果及臨床感染特點分析*

范 寧，謝立民，段雪紅△，魚麗萍，朱 琳

陜西省咸陽市第一人民醫院：1.檢驗科；2.神經內科；3.藥學室，陜西咸陽 712000

諾卡菌是一類需氧放線菌，革蘭染色為細長絲狀、分枝明顯的陽性桿菌，抗酸染色弱陽性，易引起免疫功能低下人群感染。諾卡菌培養和鑒定比較困難，臨床分離率低。隨著分子生物學技術和質譜技術的應用，其臨床分離率逐漸升高，國內諾卡菌感染病例報道數量呈上升趨勢[1-4]，但由于諾卡菌感染患者的臨床表現無特異性，易被誤診為其他疾病，如結核病、真菌感染、腫瘤等，從而延誤了疾病治療的最佳時機，甚至導致死亡[1]。現對本院2019年6月至2021年6月分離的諾卡菌的鑒定結果及臨床感染特點進行分析。

1 材料與方法

1.1菌株來源 將本院2019年6月至2021年6月來源于11例患者的12株諾卡菌作為回顧性研究樣本，剔除同一患者相同部位重復菌株。校準菌株大腸埃希菌ATCC 8739，質控菌株皮疽諾卡菌ATCC 3308。

1.2儀器與試劑 VITEK MS全自動快速微生物質譜檢測系統(法國生物梅里埃公司)、16S rRNA基因測序儀[賽音生物技術(上海)有限公司]、哥倫比亞血瓊脂平板(鄭州安圖公司)。

1.3方法 將從11例患者分離到的可疑菌株利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)進行鑒定，同時與16S rRNA基因測序結果對照；對其中7株菌進行肉湯稀釋法藥敏試驗；收集確診患者的臨床資料及實驗室檢查結果。(1)質譜鑒定。選擇24～72 h疑似菌落利用VITEK MS質譜檢測系統進行鑒定，未嵌入培養基生長的菌落按一般細菌鑒定流程操作，嵌入培養基生長的菌落按“分枝桿菌、諾卡菌流程”鑒定。所有菌株均涂兩個點位。(2)基因測序。將菌株送賽音生物技術(上海)有限公司進行16S rRNA基因測序。

2 結 果

2.1臨床資料 11例患者中男5例、女6例，年齡48～80歲、平均(64.9±11.1)歲。64%(7/11)的患者有1種及以上基礎疾病，以高血壓、冠心病、支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和糖尿病為主。2例患者放棄治療，其中患者1有肝炎、糖尿病和COPD等基礎疾病，患者9合并支氣管擴張癥和肺癌。2例無基礎疾病者未使用抗菌藥物，病情好轉。共送檢標本12份，其中呼吸道標本9份(75%，9/12)，包括痰和肺泡灌洗液各4份及1份鼻腔分泌物。見表1。

表1 11例諾卡菌感染病例臨床特點

2.2實驗室檢查數據 64%的患者白細胞計數升高，36%的患者中性粒細胞比例升高，70%的患者C反應蛋白、超敏C反應蛋白水平升高，75%的患者降鈣素原水平升高。見表2。

表2 11例諾卡菌感染病例實驗室檢查結果

2.3病原菌培養及鑒定

2.3.1顯微鏡檢查 諾卡菌革蘭染色鏡下典型形態為成簇的細長絲狀、分枝明顯的陽性桿菌，見圖1；弱抗酸染色可見紅色細長絲狀菌體，見圖2。

圖1 革蘭染色形態(×1 000)

圖2 弱抗酸染色形態(×1 000)

2.3.2菌落形態 哥倫比亞血瓊脂平板置于5%CO2培養箱35 ℃培養2～7 d或者更長時間，可見微黃色或白色、干燥菌落(圖3)或表面褶皺/堆積卷曲、嵌入平板生長的菌落(圖4)。由于菌種不同，菌落形態之間存在差異。

圖3 哥倫比亞血平板干燥菌落(3 d)

圖4 哥倫比亞血平板嵌入生長菌落(5 d)

2.3.3菌種鑒定 經基因測序，12株諾卡菌全部鑒定到種，VITEK MS質譜檢測系統鑒定到種為10株(83.3%)，未鑒定到種的包括1株天美諾卡菌(錯誤鑒定為亞洲諾卡菌)和1株豚鼠耳炎諾卡菌(無鑒定值)。見表3。

表3 VITEK MS質譜鑒定與16S rRNA基因測序結果

2.4藥敏試驗 對其中7株諾卡菌進行肉湯稀釋法藥敏試驗，結果顯示，7株諾卡菌對利奈唑胺、妥布霉素和阿米卡星全部敏感，對復方磺胺甲噁唑的敏感率為71.43%(5/7)，對阿莫西林/克拉維酸和喹諾酮類藥物全部耐藥。對頭孢曲松和亞胺培南敏感率均為57.14%(4/7)。7株諾卡菌肉湯稀釋法藥敏試驗最低抑菌濃度(MIC)結果見表4。

表4 7株諾卡菌肉湯稀釋法藥敏試驗MIC結果(μg/mL)

2.5治療與轉歸 11例患者中2例放棄治療；5例應用了復方磺胺甲噁唑，好轉出院；1例使用甲硝唑/頭孢西丁，好轉出院；1例使用美羅培南/米諾環素，癥狀緩解；2例未使用抗菌藥物。

3 討 論

諾卡菌生長緩慢，生化反應不活潑，菌種鑒定效果不佳[5]，對其鑒定到種水平通常難度較大。傳統的生化鑒定方法不僅費時費力，而且隨著菌種分類的不斷增多，鑒定到種水平受到了很大程度限制。近年來，MALDI-TOF MS技術由于其快速、準確、靈敏、自動化及高通量等特點，在微生物鑒定中的應用發展迅猛[6]。本研究利用VITEK MS系統鑒定諾卡菌，與16S rRNA基因測序結果基本一致，種鑒定率為83.3%(10/12)，由于天美諾卡菌在VITEK MS IVD V3.2版本數據庫中缺乏相關數據，被錯誤鑒定為亞洲諾卡菌，豚鼠耳炎諾卡菌由于菌落噬瓊脂生長嚴重，提取蛋白時存在瓊脂干擾，導致質譜圖譜分辨率降低而無法鑒定。陳瑩等[5]與王鵬等[6]報道利用MALDI-TOF MS技術可對85.1%和84.8%的諾卡菌鑒定到種，與本研究結果接近。美國的一項研究結果略低(76%)[7]。德國研究者則在質譜鑒定時經甲酸和乙腈處理后，種鑒定率從74.4%提高到89.7%[8]。諾卡菌分類和鑒定比較復雜，雖然MALDI-TOF MS技術可以將最常見的諾卡菌準確鑒定至種或復合物水平，但其局限性是系統數據庫不完善，對于不常見菌種，仍需通過基因測序鑒定。由于16S rRNA基因測序技術復雜且難以常規開展，CONVILLE等[9]建議使用更多的MALDI-TOF MS系統，作為第1步鑒定方法，驗證最常見的諾卡菌種，以減少需要基因測序或轉送到參考實驗室進行鑒定的菌株數量。隨著細菌分離種類的增多，數據庫的不斷更新，未來MALDI-TOF MS技術對于少見菌的鑒定準確率將提高。

不同國家和地區諾卡菌菌種分布有所不同。美國和澳大利亞最常見分離菌種為新諾卡菌，法國和泰國為皮疽諾卡菌，我國的北京和河北地區報道以圣喬治教堂諾卡菌最常見[5]。本研究以皮疽諾卡菌(41.7%，5/12)最多，其次為圣喬治教堂諾卡菌(16.7%,2/12)，與HUANG等[10]報道結果基本一致。由于國內與國外文獻關于諾卡菌報道的樣本量偏少，菌種分布的差異可能還需進一步研究、證實。

不同諾卡菌的感染部位和感染途徑有所差異，如膿腫諾卡菌、皮疽諾卡菌和蓋爾森基興諾卡菌主要造成肺部感染和播散性感染，巴西諾卡菌則常引起皮膚感染[2]。本研究1例腿部感染患者即由巴西諾卡菌引起。肺是諾卡菌最常侵犯的器官，可導致肺諾卡菌病[11]。本研究12株諾卡菌以呼吸道標本占比最高，為75%(9/12)。本研究1株天美諾卡菌分離自肺泡灌洗液，該菌是2007年在日本新發現的菌種，目前僅有4例報道[12-13]。

文獻[14]報道，諾卡菌感染者中，免疫功能低下者較非免疫功能低下者病情更重，病死率更高，但二者臨床表現無差異。本研究中64%(7/11)的患者有1種及以上基礎疾病。2例放棄治療者為典型的免疫功能低下人群，其中患者1患有肝炎、糖尿病和COPD，患者9患有支氣管擴張癥和肺癌，且二者年齡均超過70歲。2例無基礎疾病者未使用抗菌藥物，其中1例經鼻息肉摘除術后，通過鹽水沖洗、霧化治療后好轉出院，隨訪治療效果較好，考慮與局部病灶未擴散，手術治療效果較好及患者無基礎疾病有關。另1例僅針對呼吸道癥狀對癥治療后出院，不排除標本污染或者定植可能。

目前，治療諾卡菌感染首選使用磺胺類藥物，但本研究中諾卡菌對復方磺胺甲噁唑的耐藥率為28.57%，高于黃磊等[15]的報道，不同于文獻[16]報道的全部敏感，應引起重視。

綜上所述，本院分離的諾卡菌以皮疽諾卡菌為主，肺部感染為主要感染方式，患者多患有1種及以上基礎疾病，所以當臨床使用常見抗菌藥物效果不佳，患者伴有基礎疾病或使用免疫抑制劑時應考慮諾卡菌感染的可能。MALDI-TOF MS技術可對臨床少見的諾卡菌進行快速鑒定，實驗室應逐步開展諾卡菌藥敏試驗，為臨床合理用藥提供可靠依據。

志謝：本研究16S rRNA基因測序及諾卡菌藥敏試驗均由上海市東方醫院檢驗科郭建老師支持完成！