Shh、Smo、Gli1在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的表達及臨床意義*

時杜娟，黃云霞，蒙玉娜，馬淑萍，李紅玲

1.寧夏醫科大學臨床醫學院,寧夏銀川 750000；2.甘肅省人民醫院腫瘤內科，甘肅蘭州 730000

彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是成人淋巴瘤中最常見的組織亞型，占成人非霍奇金淋巴瘤的25%～35%[1]，具有高度異質性，可原發也可由惰性B細胞淋巴瘤轉化而來。在過去20年中，R-CHOP方案成為治療DLBCL的標準方案，患者治愈率為50%～70%，但復發和難治病例仍然高達40%[2]，因此，尋找新的標志物對于DLBCL的診療具有重要的臨床意義。

刺猬(HH)信號通路最早在果蠅中被發現，目前研究表明，HH信號通路不僅對胚胎發育至關重要，并且對成年生物體的組織和器官穩態起關鍵作用，該通路的激活可影響與增殖、血管生成及干細胞自我更新相關的靶基因的表達[3]。近年來研究發現，HH信號通路的異常激活可通過促進腫瘤細胞的增殖、存活、轉移，血管生成，遺傳不穩定性和腫瘤干細胞的自我更新等方式參與腫瘤的發生、發展[4]。音猬因子(Shh)、平滑受體蛋白(Smo)及神經膠質瘤相關癌基因同源蛋白1(Gli1)作為這條信號通路的關鍵蛋白因子，其異常表達與多種腫瘤的發生、發展密切相關。本研究通過免疫組織化學SP法檢測Shh、Smo、Gli1在DLBCL組織中的表達情況，探討Shh、Smo、Gli1表達與DLBCL臨床病理參數的關系，以期為DLBCL的診療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集甘肅省人民醫院2016年1月至2020年12月首次經病理學確診的DLBCL患者石蠟包埋組織標本58例。其中來源于男性32例，女性26例；患者年齡15～83歲，中位年齡54歲。收集同期20例淋巴結反應性增生患者的淋巴組織作為對照。入選患者均未行抗腫瘤治療，所有患者均以相應組織的病理活檢結果為診斷依據，診斷參照《淋巴瘤病理診斷》[5]。本研究符合醫學倫理學規范并獲甘肅省人民醫院倫理委員會批準。

1.2方法 從醫院病歷記錄中收集患者以下臨床資料：年齡、性別、An-Arbor臨床分期、B癥狀、國際預后指數(IPI)評分、骨髓侵犯情況，以及乳酸脫氫酶(LDH)、β2微球蛋白(β2-MG)、C反應蛋白(CRP)水平。入選患者的淋巴組織標本使用10%甲醛固定，常規石蠟包埋并連續切片，厚度為4 μm，使用免疫組織化學SP法檢測DLBCL組織及淋巴結反應性增生組織中Shh、Smo、Gli1的表達水平。兔抗人Shh多克隆抗體、兔抗人Smo多克隆抗體購自英國Abcam公司，兔抗人Gli1多克隆抗體購自GeneTex公司。檢測過程按照試劑盒說明書進行操作，Shh、Smo、Gli1試劑工作濃度均為1∶200，一抗對照使用磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.3判斷標準 鏡下觀察制備好的切片，采用半定量積分法：根據著色強度和著色細胞所占百分比綜合判斷。分別對Shh、Smo、Gli1陽性細胞數和染色強度兩個變量進行評分，以細胞膜或細胞質出現棕黃色顆粒為陽性染色，采用陽性細胞百分比與染色強度之積對結果進行判定。陽性細胞的評分如下：0～5%計0分，>5%～25%計1分，>25%～50%計2分，>50%～75%計3分，>75%～100%計4分。染色強度評分如下：未染色者為陰性，計0分；淡黃色者為弱染色，計1分；棕黃色者為中度染色，計2分；棕褐色者為強染色，計3分。將上述兩項評分結果相乘：0分為陰性；1～12分為陽性，其中1～4分(+，弱陽性)，5～8分(++，中度陽性)，9～12分(+++，強陽性)。以上步驟均由兩位具有豐富臨床經驗的病理科醫師采用雙盲法閱片。

1.4統計學處理 使用SPSS22.0統計軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數或率表示，組間比較采用χ2檢驗；等級變量之間的相關性采用Spearman相關進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1Shh、Smo、Gli1在DLBCL組織及淋巴結反應性增生組織中的表達 Shh在58例DLBCL組織中的陽性率為34.5%(20/58)，而在20例淋巴結反應性增生組織中的陽性率為5.0%(1/20)，差異有統計學意義(χ2=5.194，P<0.05)。DLBCL組織中Smo陽性率為41.4%(24/58)，明顯高于淋巴結反應性增生組織的5.0%(1/20)，差異有統計學意義(χ2=7.145，P<0.05)。Gli1在DLBCL組織中的陽性率為29.3%(17/58)，在淋巴結反應性增生組織中未見陽性表達，差異有統計學意義(χ2=6.307，P<0.05)。見圖1。

2.2Shh、Smo、Gli1表達與DLBCL患者臨床病理參數間的關系 Shh、Smo、Gli1的表達均與DLBCL患者的Ann-Arbor臨床分期有關(P<0.05)，且分期越晚(Ⅲ+Ⅳ期)，Shh、Smo、Gli1的陽性率越高。Shh的表達還與IPI評分有關(P<0.05)，Smo的表達還與骨髓侵犯有關(P<0.05)，而Gli1的表達還與IPI評分、B癥狀有關(P<0.05)。但三者與患者的年齡、性別，以及LDH、β2-MG、CRP水平無關(P>0.05)。見表1。

表1 Shh、Smo、Gli1表達與DLBCL患者臨床病理參數間的關系(n)

2.3Shh、Smo、Gli1在DLBCL組織中表達的相關性 經Spearman相關分析，Shh與Smo的表達呈正相關(r=0.571，P<0.01)，Shh與Gli1的表達呈正相關(r=0.678，P<0.01)，Smo與Gli1的表達呈正相關(r=0.662，P<0.01)。見表2～4。

表2 Shh與Smo在DLBCL組織中的表達情況(n)

表3 Shh與Gli1在DLBCL組織中的表達情況(n)

表4 Smo、Gli1在DLBCL組織中的表達情況(n)

3 討 論

多項研究表明，HH信號通路在多種腫瘤的發生、發展中存在異常激活[6-7]。在該通路中，目前研究最為深入的是Shh配體，其活性最高，并參與胚胎發育過程中各器官的發育。Shh配體已被證明通過調節癌細胞的增殖、惡性腫瘤轉移和腫瘤干細胞的擴張來驅動癌癥的進展。Smo是HH信號通路中的一個輔助受體，它在結構上類似于G蛋白偶聯受體，被認為是一種積極的HH信號通路調節因子。Gli1作為該通路的最終靶標，為HH信號通路提供正反饋。HH信號通路在腫瘤中的異常激活存在多種方式，包括依賴配體的激活及非依賴配體的激活，其中依賴配體的激活還包括自分泌、旁分泌機制和反向旁分泌機制[8]。有研究報道，在基底細胞癌患者中經常出現表達Smo的體細胞突變，這是通過非依賴配體的方式激活HH信號通路[9]，在髓母細胞瘤(MB)中也存在同樣的方式，TAN等[10]由此分析了38例MB的Shh亞型(Shh-MB)患者的數據，結果顯示80%的Smo突變優先在小腦半球中形成，在成人腫瘤中Smo突變率更高，從而推測成人Shh-MB的突變似乎會影響腫瘤的定位。

目前關于HH信號通路在DLBCL中的作用研究甚少，故本研究通過免疫組織化學SP法檢測了DLBCL組織中Shh、Smo、Gli1的表達情況。結果表明，Shh、Smo、Gli1在DLBCL組織中的表達明顯高于淋巴結反應性增生組織，Shh、Smo、Gli1的表達均與Ann-Arbor臨床分期有關(P<0.05)，這表明以Shh為配體的HH信號通路可能在DLBCL的疾病進展中發揮重要作用。Shh的表達還與IPI評分有關(P<0.05)，而Smo的表達還與骨髓侵犯有關(P<0.05)，Gli1的表達與IPI評分、B癥狀有關(P<0.05)。有報道稱，Shh和Gli1為接受治療性手術的胰腺癌患者提供了重要和獨立的預后信息，腫瘤細胞低水平表達Gli1或Shh與較長的無病生存期和總生存期有關，Gli1和Shh是潛在的生物預后標志物[11]。總之，HH信號通路可能參與了DLBCL細胞的增殖并促進腫瘤的轉移。

近年來以HH信號通路關鍵蛋白為作用靶點的抗腫瘤藥物研究也是一大熱點，ALAM等[12]研究表明，運用Shh抑制劑環巴胺可以抑制大鼠腫瘤血管內皮細胞增殖和遷移，減緩腫瘤的增殖和侵襲。針對Smo基因位點的抑制劑，通過抑制Smo活性可直接阻斷Gli1轉錄因子的激活，抑制下游基因的表達。目前維莫德吉和索尼吉布已被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準上市用于治療基底細胞癌[13-14]，但是隨著獲得性耐藥的出現也限制了Smo抑制劑的長期療效[15]。目前針對Gli1基因的靶向抑制劑有GANT61、ATO、格拉斯吉布和GANT58等，格拉斯吉布和小劑量阿糖胞苷聯用也被美國FDA批準用于治療急性粒細胞白血病[16]。這為使用HH信號通路抑制劑聯合其他藥物治療惡性腫瘤提供了一個新的思路。

本研究結果顯示，在DLBCL組織中存在HH信號通路的過度激活，并參與了DLBCL的發生、發展，這表明Shh配體介導的HH信號通路的過度激活在DLBCL的疾病進展中發揮獨特的作用。但由于納入樣本量有限，時間跨度較大，可能造成選擇性偏倚，導致統計結果出現差異。并且目前部分樣本的隨訪時間較短，因此,三者是否與DLBCL患者的生存期及預后有關仍需要進一步驗證并隨訪。

綜上所述，本研究的結果顯示Shh、Smo、Gli1在DLBCL中過表達，表明HH信號通路與DLBCL發生、發展密切相關，有望為DLBCL的治療提供新的思路。關于HH信號通路在DLBCL發生、發展中的具體機制及與預后的相關性目前仍有待進一步的研究。