血清miR-520d-3p和miR-627檢測(cè)在創(chuàng)傷性腦損傷診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)中的臨床價(jià)值*

閆 靜，李 全，李丹丹，季明德△

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 210029；2.南京大學(xué)附屬金陵醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 210002

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的發(fā)病率正逐年上升，在年輕人及兒童中尤為突出。重度創(chuàng)傷性腦損傷(sTBI)的高致死率、高致殘性嚴(yán)重影響人類的生命健康和生活質(zhì)量。盡管絕大多數(shù)輕度創(chuàng)傷性腦損傷(mTBI)患者傷后無須治療，但部分患者會(huì)持續(xù)進(jìn)展為腦震蕩綜合征，并在認(rèn)知、行為、精神等方面表現(xiàn)出不同程度的功能障礙[1]。目前臨床上主要依靠患者的臨床癥狀、體征、影像學(xué)檢查，如電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)(SPECT)和實(shí)驗(yàn)室檢查[神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、鈣結(jié)合蛋白B(S100B)、微管相關(guān)蛋白Tau、髓鞘堿性蛋白(MBP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)]等對(duì)TBI進(jìn)行診斷，然而這些檢測(cè)方法在sTBI的療效評(píng)估與預(yù)后評(píng)估方面存在不同程度的局限性，并且針對(duì)影像學(xué)表現(xiàn)正常的mTBI患者，大部分實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)的敏感性極低，給mTBI的判定帶來一定的困擾[2]。因此，目前迫切需要尋找一種簡(jiǎn)便、特異的新型生物標(biāo)志物判斷TBI患者的病情、療效及預(yù)后情況，這對(duì)mTBI患者能夠及時(shí)進(jìn)行診斷、治療具有重要的臨床意義。

微小核糖核酸(miRNA)是一類內(nèi)源性高度保守的非編碼單鏈小RNA，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)，參與調(diào)控多種生物學(xué)過程[3]。目前，多項(xiàng)研究顯示TBI患者血清miRNA表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，miRNA具有潛在的生物學(xué)診斷價(jià)值[3-6]。因此，本研究旨在對(duì)不同嚴(yán)重程度TBI患者及其治療前后血清miR-520d-3p和miR-627的表達(dá)水平進(jìn)行分析，探討其與預(yù)后的關(guān)系，以期為TBI的診斷、療效評(píng)估、預(yù)后監(jiān)測(cè)提供新的方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2014年7月至2017年7月在南京大學(xué)附屬金陵醫(yī)院確診的134例TBI患者及67例健康對(duì)照者(健康對(duì)照組)納入研究。健康對(duì)照組中男54例、女13例，年齡(49.30±11.82)歲。采用格拉斯哥昏迷指數(shù)評(píng)分(GCS)系統(tǒng)，將GCS>12分的TBI患者納入mTBI組(67例)，其中男48例、女19例，年齡(45.67±15.13)歲；GCS≤8分的TBI患者納入sTBI組(67例)，其中男54例、女13例，年齡(49.22±11.80)歲。TBI患者納入標(biāo)準(zhǔn):(1)頭顱創(chuàng)傷24 h以內(nèi);(2)近期無其他手術(shù)史及藥物治療史。另外，所有TBI患者于傷后6個(gè)月利用格拉斯哥預(yù)后等級(jí)評(píng)分(GOS)進(jìn)行預(yù)后評(píng)價(jià)，將GOS≤3分的患者作為預(yù)后差組，GOS>3分的患者作為預(yù)后好組。本研究的所有研究對(duì)象均知情同意，且得到倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(文件號(hào)：2015NZGKJ-019)。3組研究對(duì)象的年齡、性別、舒張壓、收縮壓比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 3組研究對(duì)象的一般資料比較

1.2儀器與試劑 采用上海醫(yī)療器械公司的高速離心機(jī)分離血清；檢測(cè)儀器為美國Applied Biosystems(ABI)公司的7300型PCR儀；提取RNA的試劑采用索萊寶公司的酸性水飽和酚和上海國藥集團(tuán)試劑公司的分析純級(jí)氯仿、異丙醇、無水乙醇；RNA保存于DEPC處理水(美國Sigma公司)中；反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)體系所用試劑購自大連TaKaRa公司；miR-520d-3p和miR-627探針及人工合成的peu-miR-2911購自美國ABI公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集與處理 采用真空采血促凝管收集健康對(duì)照者的清晨空腹血(禁食12 h以上)和TBI患者(入院時(shí)首次采集，以及經(jīng)2～8周治療后采集，病情好轉(zhuǎn)者出院當(dāng)日再次采集)的空腹靜脈血標(biāo)本3.5 mL。所有受試者的血標(biāo)本均離心后取上層血清，并置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2血清miR-520d-3p和miR-627表達(dá)水平測(cè)定 采用Trizol提取法提取血清中的總RNA。通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及TaqMan探針將miR-520d-3p和miR-627分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用ABI 7300 qRT-PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。以miR-2911作為外參，在標(biāo)本提取過程中加入20 μL 106 fmol/L miR-2911(5′-GGCCGGGGGACGGGCUGGGA-3′)，監(jiān)測(cè)標(biāo)本提取過程，并將待測(cè)miRNA與miR-2911同時(shí)檢測(cè)。擴(kuò)增結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線設(shè)定統(tǒng)一閾值，用儀器自帶的分析軟件分析擴(kuò)增曲線，獲得待測(cè)miRNA與miR-2911的Ct值，miR-520d-3p和miR-627的表達(dá)水平采用相對(duì)定量法(2-ΔCt，ΔCt=CtmiRNA-CtmiR-2911)進(jìn)行計(jì)算。為了降低誤差，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

2 結(jié) 果

2.13組血清miR-520d-3p和miR-627表達(dá)水平比較 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，mTBI組和sTBI組患者血清miR-520d-3p和miR-627表達(dá)水平均明顯升高，且sTBI組患者血清miR-520d-3p和miR-627表達(dá)水平明顯高于mTBI組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組血清miR-520d-3p和miR-627的表達(dá)水平比較[M(P25,P75)]

2.2TBI患者治療前后血清miR-520d-3p和miR-627表達(dá)水平比較 分析所納入研究的TBI患者入院時(shí)及經(jīng)2～8周治療后的血清miR-520d-3p和miR-627的水平變化，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與治療前相比，治療后患者的miR-520d-3p和miR-627表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 TBI患者治療前后血清miR-520d-3p和miR-627表達(dá)水平比較[M(P25,P75)]

2.3不同預(yù)后的TBI患者血清miR-520d-3p和miR-627表達(dá)水平比較 預(yù)后差組37例，預(yù)后好組97例。結(jié)果顯示，與預(yù)后好組相比，預(yù)后差組的miR-520d-3p和miR-627表達(dá)水平明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同預(yù)后的TBI患者血清miR-520d-3p和miR-627表達(dá)水平比較[M(P25,P75)]

2.4TBI患者血清miR-520d-3p和miR-627表達(dá)水平的診斷價(jià)值 繪制ROC曲線，分析血清miR-520d-3p和miR-627對(duì)TBI的診斷效能。結(jié)果顯示，血清miR-520d-3p診斷mTBI的AUC為0.866(95%CI:0.800～0.933，P<0.05)，診斷sTBI的AUC為0.913(95%CI:0.813～0.965，P<0.05)，鑒別診斷mTBI與sTBI的AUC為0.622(95%CI:0.527～0.718，P<0.05)，見圖1A。血清miR-627診斷mTBI的AUC為0.832(95%CI:0.763～0.903，P<0.05)，診斷sTBI的AUC為0.890(95%CI:0.839～0.946，P<0.05)，鑒別診斷mTBI與sTBI的AUC為0.651(95%CI:0.558～0.743，P<0.05)，見圖1B。

注：A為miR-520d-3p；B為miR-627；1為區(qū)分mTBI患者與健康對(duì)照者；2為區(qū)分sTBI患者與健康對(duì)照者;3為區(qū)分mTBI與sTBI患者；4為參考線。

3 討 論

臨床上判定TBI的首選檢查方法是CT，但其敏感性較低，尤其是大部分mTBI患者的影像學(xué)表現(xiàn)無異常變化，臨床醫(yī)生僅能根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和GCS進(jìn)行判斷，難以準(zhǔn)確判定mTBI。盡管MRI可以提高對(duì)微小病灶的檢出率，但費(fèi)用昂貴，患者難以負(fù)擔(dān)，限制了其的推廣和應(yīng)用。目前已知的實(shí)驗(yàn)室大分子蛋白標(biāo)志物對(duì)于TBI的診斷缺乏特異性[4]。因此，尋找一種新型、特異的生物標(biāo)志物顯得尤為重要。

miRNA具有高度保守性、時(shí)序性和組織器官特異性，且可調(diào)節(jié)人體各個(gè)系統(tǒng)的生理功能及參與疾病的發(fā)生、發(fā)展[5]。目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA高表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、分化等重要生理過程[6-7]。多項(xiàng)研究結(jié)果提示miRNA與TBI的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，是診斷TBI潛在的生物標(biāo)志物[2-3]。

本研究前期采用低密度芯片技術(shù)篩選出miR-520d-3p和miR-627，結(jié)合qRT-PCR技術(shù)分析、驗(yàn)證兩種miRNA在不同嚴(yán)重程度的TBI患者血清中的特異性表達(dá)情況，并觀察了TBI患者治療好轉(zhuǎn)后的miR-520d-3p和miR-627表達(dá)水平變化情況。同時(shí)，結(jié)合患者出院后6個(gè)月的GOS進(jìn)行綜合分析，判斷其預(yù)后情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-520d-3p和miR-627在不同嚴(yán)重程度的TBI患者血清中都呈高表達(dá)，且sTBI組的表達(dá)水平明顯高于mTBI組，提示miR-520d-3p和miR-627可能與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。因此，有理由推測(cè)表達(dá)水平升高的miR-520d-3p和miR-627可能通過調(diào)控某種蛋白進(jìn)而使顱腦損傷后的病情惡化。本研究結(jié)果提示，miR-520d-3p和miR-627可以作為TBI患者潛在的診斷標(biāo)志物，尤其為影像學(xué)表現(xiàn)正常的mTBI的診斷提供了較大的幫助，降低漏診率。當(dāng)患者病情好轉(zhuǎn)，炎癥指標(biāo)基本恢復(fù)正常，腦水腫等癥狀明顯減輕后，miR-520d-3p和miR-627的表達(dá)水平也明顯下降，提示miR-520d-3p和miR-627可為療效觀察提供有效的基因?qū)W依據(jù)。另外，預(yù)后差組的miR-520d-3p與miR-627的表達(dá)水平明顯高于預(yù)后好組，提示miR-520d-3p和miR-627的表達(dá)水平與預(yù)后密切相關(guān)，可以作為TBI患者預(yù)后判斷的敏感指標(biāo)。鑒于此，筆者推測(cè)血清miR-520d-3p和miR-627可能參與TBI病理過程的發(fā)生、發(fā)展，當(dāng)腦組織受損時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞主動(dòng)或被動(dòng)釋放miR-520d-3p和miR-627，并通過血腦屏障釋放到血液中，本課題組也會(huì)在后續(xù)開展相關(guān)機(jī)制的研究。

ROC曲線分析顯示，血清miR-520d-3p和miR-627不僅可以較好地區(qū)分健康人和sTBI患者，對(duì)健康人和mTBI患者也有較好的區(qū)分作用。同時(shí)對(duì)mTBI和sTBI也具有一定的鑒別診斷能力。由此可見，miR-520d-3p和miR-627不僅反映顱腦損傷的嚴(yán)重程度，對(duì)評(píng)估療效和預(yù)后有重要意義，而且還可作為TBI潛在的診斷標(biāo)志物。

TBI的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前相關(guān)報(bào)道常涉及神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)、可塑性改變等[8]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-520d-3p和miR-627在神經(jīng)系統(tǒng)性疾病中發(fā)揮著重要的生理、病理作用。DESHPANDE等[9]證實(shí)，miR-520d-3p通過靶向抑制信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞惡性程度的升高，提示miR-520d-3p可作為星形細(xì)胞瘤的診斷標(biāo)志物。FAN等[10]發(fā)現(xiàn)，miR-627通過靶向NR2C2蛋白調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的惡化。然而，目前較缺乏miR-520d-3p和miR-627在TBI發(fā)病機(jī)制中的研究。本課題組后續(xù)將在動(dòng)物與細(xì)胞水平上開展機(jī)制研究，以期為TBI的診斷、治療提供理論依據(jù)。