一株維氏氣單胞菌的分離鑒定及藥敏特性研究

張鳳賢　劉曉麗　李全振　王鳳敏　王圓圓　蔣紅艷　楊蕾

摘要：從邯鄲魏縣患病錦鯉（Cyprinus carpio koi）體內(nèi)分離獲得一株革蘭氏陰性菌，對其形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA序列進行分析，鑒定其為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）;經(jīng)人工感染試驗，發(fā)現(xiàn)菌液濃度3.0×1010CFU/mL下感染錦鯉發(fā)病，對發(fā)病錦鯉進行病原菌分離、觀察、生理生化特性鑒定及16S rDNA序列分析，與感染試驗菌株為同一種菌。采用微量肉湯稀釋法對該菌株進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)其對鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星、氟甲喹、氟苯尼考、甲砜霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶敏感，對硫酸新霉素中度敏感。

關(guān)鍵詞：錦鯉（Cyprinus carpio koi）;維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）;分離鑒定;人工感染;藥敏試驗

錦鯉（Cyprinus carpio koi）色彩艷麗、花紋多變、體格健美、泳姿雄然，是和平、幸福、長壽的象征，是一種高檔觀賞魚，具有“水中活寶石”的美稱。隨著社會發(fā)展和人們生活水平的提高，錦鯉的市場需求越來越多，錦鯉養(yǎng)殖具有廣闊的市場前景，但錦鯉患病嚴重影響?zhàn)B殖戶的收入，制約錦鯉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。雖然目前造成錦鯉大量死亡的原因以鯉浮腫病、錦鯉皰疹病毒病等病毒類疫病為主，但日益頻發(fā)的細菌性疾病也給錦鯉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了巨大損失，如銅綠假單胞菌、氣單胞菌、希瓦氏菌、少動鞘氨醇單胞菌等[1]。

氣單胞菌（Aeromonas）廣泛存在于江河或沿岸，是魚類的重要病原菌，為革蘭氏陰性短桿菌，主要種類有：維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）、簡氏氣單胞菌（Aeromonas jandaei）、中間氣單胞菌（Aeromonas media）和殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）等[2-3]。

自2015年以來，全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站在全國包括河北省在內(nèi)的十幾個省連續(xù)開展“水產(chǎn)養(yǎng)殖動物主要病原菌耐藥性監(jiān)測”工作[4]，根據(jù)2021年河北省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原菌耐藥性的研究和分析，在監(jiān)測地區(qū)分離得到的氣單胞菌以維氏氣單胞菌為主（占氣單胞菌總數(shù)的92.50%），所以做好維氏氣單胞菌的監(jiān)測及預(yù)防研究非常重要。本研究通過對發(fā)病錦鯉體內(nèi)分離得到的一株維氏氣單胞菌的人工感染和藥敏試驗研究，為魚類實際生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中維氏氣單胞菌感染的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

LB肉湯、LB營養(yǎng)瓊脂、細菌生化鑒定管及配套相關(guān)試劑購自青島海博生物技術(shù)有限公司，藥敏分析試劑板購自南京菲恩醫(yī)療科技有限公司，PCR相關(guān)試劑購自TakaRa公司?；疾″\鯉取自河北邯鄲魏縣某錦鯉養(yǎng)殖場，健康錦鯉購自石家莊市某養(yǎng)殖場，體長10～13 cm。

1.2試驗方法

1.2.1病原菌的分離純化2021年4月將邯鄲魏縣某錦鯉養(yǎng)殖場患病錦鯉帶回實驗室，無菌操作條件下解剖，用接種環(huán)取其肝臟、脾臟、腎臟組織，劃線于LB固體培養(yǎng)基進行病原菌的分離培養(yǎng)，25 ℃，培養(yǎng)48 h，挑選優(yōu)勢菌落純化培養(yǎng)3次，得到純化菌株命名為WX-11。將純化菌株WX-11挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，25 ℃，過夜振蕩培養(yǎng)18 h，保存甘油菌（25%甘油濃度）于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2病原菌的形態(tài)和生理生化特性鑒定試驗觀察菌株WX-11在LB固體培養(yǎng)基上的菌體形態(tài)特征，并進行革蘭氏染色，鏡檢觀察;利用細菌生化鑒定管，根據(jù)鑒定管使用說明書對其進行生理生化特性鑒定。

1.2.3病原菌的16S rDNA序列分析對菌株WX-11進行基因組DNA提取，然后采用通用引物（27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R： 5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3）進行PCR擴增，獲得16S rDNA序列產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物送派諾森生物科技有限公司進行基因測序，測序結(jié)果與NCBI Blast數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析，確定種屬。

1.2.4人工感染試驗選取健康、游動快速的錦鯉40尾，在（18±2）℃的水箱中暫養(yǎng)1周，養(yǎng)殖期間連續(xù)供氧，定時換水、投喂飼料，確認健康無病后用于人工感染試驗，試驗前1 d停止投喂。感染試驗在58 L的塑料魚槽中進行，控制水溫（18±2）℃，日換水量70%，感染期間連續(xù)供氧，不投喂飼料，養(yǎng)殖污染用水經(jīng)二氧化氯消毒處理后排放。

1.2.4.1菌懸液的制備接種菌株WX-11甘油菌到LB液體培養(yǎng)基中（接種量0.1‰），25 ℃，100 r/min，過夜振蕩培養(yǎng)18 h;獲得的菌懸液，4 ℃，8 000 r/min，離心5 min，棄上清，用無菌生理鹽水（0.90% NaCl溶液）離心洗滌3次，然后將菌體沉淀用無菌生理鹽水重懸，采用麥氏比濁管及平板計數(shù)校對方法，調(diào)整菌懸液濃度分別為3.0×106、3.0×108、3.0×1010? CFU/mL。

1.2.4.2感染注射采用泄殖腔注射法將制備好的各濃度（3.0×106、3.0×108、3.0×1010? CFU/mL）菌懸液注射到健康錦鯉體內(nèi)進行感染試驗，每尾魚注射1 mL，每個濃度菌懸液注射10尾魚;同時，設(shè)置對照組1組，10尾魚，每尾魚注射1 mL的生理鹽水（0.90% NaCl）。感染各濃度及對照組錦鯉分別放入不同水槽中進行試驗觀察，試驗期間不投喂飼料，連續(xù)供氧，每日定時換水，日換水量70%。

1.2.4.3觀察和解剖試驗期間，每天觀察和記錄各水槽中魚體發(fā)病和水質(zhì)變化情況，連續(xù)觀察10 d，及時撈出死亡或瀕臨死亡有典型臨床癥狀的魚體，在無菌操作條件下解剖，對鰓、肝、脾、腎及其它內(nèi)臟進行臨床癥狀觀察并拍照留存，用接種環(huán)取肝、脾、腎、鰓組織劃線于LB固體培養(yǎng)基中，按1.2.1中的方法進行病原菌的分離純化培養(yǎng)。23B3DDFF-5A1D-4415-A2CA-707364C09F19

1.2.5藥敏試驗采用微量肉湯稀釋法對菌株WX-11進行藥敏試驗，具體操作方法依照藥敏分析試劑板使用說明書。

2結(jié)果與分析

2.1菌株WX-11的形態(tài)和生理生化特性

菌株WX-11在LB固體培養(yǎng)基中生長淺灰色圓形菌落，邊緣整齊，中間微凸起，表面光滑，不透明（見封三圖1）。經(jīng)革蘭氏染色為革蘭氏陰性短桿菌（見封三圖2）。

菌株WX-11的生理生化特性鑒定結(jié)果見表1。

由表可知，菌株WX-11可分解利用甘露醇，不能分解利用肌醇、山梨醇、蜜二糖、核糖醇和棉子糖;不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚;可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶;有動力;不產(chǎn)生鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶;發(fā)酵不產(chǎn)生硫化氫;不產(chǎn)生尿素酶;不可以利用檸檬酸鹽;MR、VP試驗陽性。

根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[5]，菌株WX-11的形態(tài)特征和生理生化特性與維氏氣單胞菌高度相似。

2.2菌株WX-11的16S rDNA序列分析結(jié)果

根據(jù)測序結(jié)果，菌株WX-11的16S rDNA序列長度為1 503 bp，與NCBI Blast數(shù)據(jù)庫中的序列比對分析，發(fā)現(xiàn)菌株WX-11與維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）的同源性大于99.0%。

綜合菌株WX-11的形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析結(jié)果，確定菌株WX-11為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）。

2.3人工感染試驗結(jié)果

感染W(wǎng)X-11菌液濃度為3.0×1010? CFU/mL的錦鯉，在感染后18 h開始出現(xiàn)死亡，24 h死亡率達到40%，48 h死亡率達到60%，48 h～10 d無死亡。發(fā)病錦鯉臨床癥狀主要表現(xiàn)為：體表（見圖2中的①②圖）出血，尾鰭、背鰭、臀鰭出血，肛門紅腫，腹部紅腫，解剖（見圖2中的③圖）鰓發(fā)白，有腹水，腸道出血，肝、脾、腎出血，初步診斷為細菌性感染癥狀。

感染3.0×106? CFU/mL和3.0×108? CFU/mL兩個濃度的錦鯉，試驗期間游動情況良好、外觀正常，水質(zhì)良好，無死亡，試驗10 d時，對感染錦鯉進行解剖，發(fā)現(xiàn)肝、脾、腎及腸道均出現(xiàn)不同程度的出血，同樣呈現(xiàn)出細菌性感染癥狀。

對照組試驗錦鯉游動和水質(zhì)良好，未出現(xiàn)死亡和臨床癥狀表現(xiàn)。

感染試驗結(jié)果見表2。

從感染發(fā)病錦鯉體內(nèi)分離得到的病原菌經(jīng)LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)形態(tài)觀察、革蘭氏染色鏡檢、生理生化特性和16S rDNA序列分析，與感染菌株WX-11一致。

2.4藥敏試驗結(jié)果

根據(jù)菌株WX-11藥敏試驗結(jié)果，獲得各藥物對該菌株的最小抑菌濃度MIC，見表3。

由上表最小抑菌濃度MIC可知，WX-11對鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星、氟甲喹、氟苯尼考、甲砜霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶敏感，對硫酸新霉素中度敏感。

3討論

氣單胞菌為淡水魚類的主要病原菌，廣泛存在于江河或沿岸，而維氏氣單胞菌作為目前河北省監(jiān)測地區(qū)范圍內(nèi)主要氣單胞菌種類，其特性的研究和防治對魚類養(yǎng)殖非常重要。

研究中通過對菌株WX-11生理生化特性的研究發(fā)現(xiàn)該菌可分解利用甘露醇;可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶;有動力;不能分解利用肌醇、山梨醇、蜜二糖、核糖醇和棉子糖;不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚;不產(chǎn)生鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶;發(fā)酵不產(chǎn)生硫化氫;不產(chǎn)生尿素酶;不可以利用檸檬酸鹽;MR、VP試驗陽性。其他特性待進一步研究。

本研究中的人工感染試驗說明菌株WX-11具有較強的毒力，對錦鯉的致死濃度是3.0×1010? CFU/mL，感染錦鯉后有肝、脾、腎和腸道出血等典型臨床癥狀表現(xiàn)，在魚類生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，當(dāng)存在養(yǎng)殖密度過大、水污染等不利魚類生長的情況時，魚類機體免疫力下降，作為條件致病菌維氏氣單胞菌可能會感染魚體發(fā)病，甚至造成大量死亡。

通過研究中的藥敏試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株WX-11對鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星、氟甲喹、氟苯尼考、甲砜霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶敏感，對硫酸新霉素中度敏感。結(jié)合國務(wù)院獸醫(yī)主管部門批準的水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥，試驗結(jié)果可以合理指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖中維氏氣單胞的感染預(yù)防和治療用藥，有效控制濫用藥和過量用藥現(xiàn)象的發(fā)生。

4結(jié)論

維氏氣單胞菌可以感染引起錦鯉發(fā)病死亡，且具有體表、鰭出血，肛門、腹部紅腫，肝、脾、腎、腸道出血等典型臨床癥狀表現(xiàn)。在魚類水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，可以利用鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星、氟甲喹、氟苯尼考、甲砜霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶等抗生素進行維氏氣單胞菌感染的魚類疾病的防治。

參考文獻：

[1] 苗淼，呂愛軍，胡秀彩，等.錦鯉廈門希瓦氏菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，4（1）：172-177.

[2] 王聞卿，朱林英，郝莉鵬，等.氣單胞菌研究概況[J].疾病監(jiān)測，2016，31（7）：591-597.

[3] 譚愛萍.水產(chǎn)動物源氣單胞菌耐藥性與質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥研究[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[4] 全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站.2020年全國水產(chǎn)養(yǎng)殖動物主要病原菌耐藥性監(jiān)測分析報告[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2021：前言.

[5] 東秀珠，蔡妙英，等.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001：106-119.

Isolation，identification and antibiotic susceptibility analysis

of a strain of Aeromonas veronii23B3DDFF-5A1D-4415-A2CA-707364C09F19

ZHANG Fengxian LIU Xiaoli LI Quanzhen WANG Fengmin

WANG Yuanyuan JIANG Hongyan YANG Lei1

Abstract：A Gram-negative strain of bacteria was isolated from diseased Cyprinus carpio koi from Wei County in Handan.The strain was identified as Aeromonas veronii by morphological characteristics，physiological，biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis. It was found that the Cyprinus carpio koi was infected with the concentration of the strain of 3.0×1010CFU/mL in artificial infection test. The isolated pathogenic bacteria from the infected Cyprinus carpio koi were identified as the same strain as the experimental strain by morphological characteristics observation，physiological，biochemical characteristics identification and 16S rDNA sequence analysis. It was found that the strain was sensitive to doxycycline hydrochloride，enrofloxacin，flumequine，flubenicol，methanomycin，sulfamethoxazole sodium，sulfamethoxazole + trimethoprim，and moderately sensitive to neomycin sulfate.

Key words：Cyprinus carpio koi;Aeromonas veronii;isolation and identification;artificial infection;antibiotic susceptibility test

基金項目：財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（項目編號：CARS-45）;河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系淡水養(yǎng)殖創(chuàng)新團隊（項目編號：HBCT2018180207）資助。

作者簡介：張鳳賢（1979-），女，碩士，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控技術(shù)。E-mail：14578673@qq.com。DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2022.06.00223B3DDFF-5A1D-4415-A2CA-707364C09F19