慢病毒載體介導過表達和敲低miR-155的AB 8/13細胞株的建立

唐志明　林栩　梁釗　王晨　韋美理　王蓉　吳昱升　黃慕源

【摘要】目的利用慢病毒載體構建穩定過表達miR-155的AB 8/13細胞株（AB 8/13-LV-has-miR-155）和穩定敲低miR-155的AB 8/13細胞株（AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton），為研究miR-155在足細胞焦亡和腎臟疾病中的作用奠定基礎。方法體外培養AB 8/13細胞，使用不同濃度嘌呤霉素刺激AB 8/13細胞48 h，在光學顯微鏡下觀察AB 8/13細胞的死亡情況;使用LV-has-miR-155陰性對照病毒、LV-has-miR-155-5p inhibiton陰性對照病毒分別感染AB 8/13細胞，在熒光顯微鏡下觀察AB 8/13細胞的狀態和感染效率;在嘌呤霉素篩選出穩定細胞株后，通過實時熒光定量PCR法檢測穩定細胞株的miR-155表達量。結果在3.5 μg/mL及以上濃度的嘌呤霉素作用于AB 8/13細胞48 h后，所有細胞全部死亡。LV-has-miR-155慢病毒感染AB 8/13細胞的感染效率達到80%的最佳條件為在含HiTransG P的完全培養基中進行感染，MOI為10;LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒感染AB 8/13細胞的感染效率達到80%的最佳條件為在含HiTransG A的完全培養基中進行感染，MOI為100。qRT-PCR結果顯示AB 8/13-LV-has-miR-155細胞株的miR-155表達量明顯升高，AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton細胞株的miR-155表達量降低。結論成功構建AB 8/13-LV-has-miR-155穩定細胞株和AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton穩定細胞株，為進一步探究miR-155在人足細胞焦亡中的作用機制奠定基礎。

【關鍵詞】AB 8/13細胞;慢病毒載體;miR-155

中圖分類號：R692文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.05.001

Establishment of overexpression and knockdown of miR-155

genes of AB 8/13 cell lines by lentivirus vector

TANG Zhiming LIN Xu LIANG Zhao WANG Chen WEI Meili WANG Rong WU Yusheng HUANG Muyuan

（1.Department of Nephrology， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities; 2. Guangxi Key

Laboratory of Basic Guarantee for Medical Research of Immune-related Diseases， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】ObjectiveTo construct the stable overexpression of miR-155 of AB 8/13 cell line （AB 8/13-LV-has-miR-155） and stable knockdown of miR-155 of AB 8/13 cell line （AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton） by lentivirus vector， so as to? lay a foundation for the study of the role of miR-155 in podocyte pyroptosis and kidney diseases. MethodsAB 8/13 cells were cultured in vitro and stimulated with puromycin at different concentrations for 48 hours， and then the death of AB 8/13 cells was observed under optical microscope. After AB 8/13 cells were respectively? infected with LV-has-miR-155 negative control virus and LV-has-miR-155p inhibiton negative control virus， the state and infection efficiency of AB 8/13 cells were observed under fluorescence microscope. After the stable cell lines were screened by puromycin， the expression of miR-155 in the stable cell line was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. ResultsAfter being treated with puromycin at the concentration of 3.5 μg/mL or above for 48 hours， all AB 8/13 cells died. The optimal conditions for AB 8/13 cells infected with LV-has-miR-155 lentivirus to achieve 80% infectious efficiency were as follows： infection was performed in complete medium containing HiTransG P， and MOI was 10. The optimal conditions for AB 8/13 cells infected with LV-has-miR-155p inhibiton lentivirus to achieve 80% infectious efficiency were as follows： infection was performed in complete medium containing HiTransG A， and MOI was 100. QRT-PCR results showed that the expression of miR-155 in AB 8/13-LV-has-miR-155 cell line increased significantly， and the expression of miR-155 in AB 8/13-LV-has-miR-155 inhibiton cell line decreased. ConclusionTo successfully construct AB 8/13-LV-has-miR-155 stable cell lines and AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton stable cell lines can lay a foundation for further exploring the mechanism of miR-155 in human podocyte pyroptosis.9F60236C-D85B-47C2-8353-F753D7AE81E8

【Key words】AB 8/13 cell; lentivirus vector; miR-155

Micro RNA （miRNA）是一類內源性、長度為20～24個核苷酸的非編碼RNA，其通過對轉錄后靶基因的調節，進而對正常生理、病理生理、疾病發展等過程起著關鍵性的調控作用。miR-155是一種重要的miRNA，其影響著IgA腎病、急性腎損傷、糖尿病腎病等疾病的發生發展[1～3]。足細胞作為一種重要的臟層上皮細胞，與基底膜、血管內皮細胞一起參與了腎小球的過濾功能。目前的研究表明，足細胞在微小病變腎病、糖尿病腎病、膜性腎病、狼瘡性腎炎、局灶節段性腎小球硬化（FGSG）等腎臟疾病中受到損傷，并且足細胞損傷可以加重腎臟疾病的發展[4]。本課題組前期研究顯示在TGF-β1誘導的小鼠足細胞損傷模型中miR-155高表達，降低miR-155表達量減輕足細胞損傷[5]。我們近期研究發現在LPS+ATP誘導的人足細胞焦亡中miR-155表達升高。綜上，miR-155可能參與了腎臟疾病中足細胞焦亡的損傷機制。但是，目前尚無文獻報道miR-155在足細胞焦亡中的具體作用機制。本研究通過過表達和敲低miR-155的慢病毒載體感染人足細胞AB 8/13，建立AB 8/13-LV-has-miR-155細胞株和AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton細胞株，為下一步研究miR-155在足細胞焦亡中的作用機制奠定前期基礎。

1材料與方法1.1材料人腎小球足細胞株（AB 8/13）獲贈于英國Bristol大學Moin A. Saleem教授。RPMI1640培養基（美國 Gibco），胎牛血清（烏拉圭 Lonsera），ITS（美國 Sigma-Aldrich），胰酶（中國 Solarbio），青鏈霉素混合液（中國 Solarbio），Trizol試劑（美國 Invitrogen），miRNA第一條鏈cDNA合成試劑盒（中國 Sangon Biotech，#B532451），TB Green? Premix Ex Taq^TMⅡ （日本 TaKaRa，RR820A），由武漢金開瑞生物工程有限公司合成U6 Forward primer、U6 Reverse primer、miRNA-155 Forward primer，引物序列見表1，miRNA-155 Reverse primer由試劑盒自帶。攜帶過表達miR-155基因的慢病毒（LV-has-miR-155）、過表達miR-155的陰性對照慢病毒（LV-has-miR-155 nc）、攜帶敲低miR-155基因的慢病毒（LV-has-miR-155-5p inhibiton）、敲低miR-155的陰性對照慢病毒（LV-has-miR-155-5p inhibiton nc）、HitransG A、HitransG P均購買于上海吉凱基因醫學科技股份有限公司。

1.2AB 8/13細胞培養細胞復蘇后，在33℃、5% CO₂條件下，使用完全培養基（10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液+ITS 〔Insulin-Transferrin-Selenium〕+RPMI-1640）培養未分化的AB 8/13細胞，每2～3天更換一次培養基，細胞匯合度達80%左右進行傳代。

1.3AB 8/13細胞嘌呤霉素工作濃度的篩選將4×10⁴～5×10⁴個對數生長期AB 8/13細胞鋪于24孔板，將細胞培養至細胞匯合達80%左右;然后于每孔加入不同濃度的嘌呤霉素，濃度從0 μg/mL開始，以后每孔依次增加0.5 μg/mL，直到嘌呤霉素濃度達到10 μg/mL;繼續培養AB 8/13細胞48 h，于顯微鏡下觀察;將所有細胞殺光的最低嘌呤霉素濃度選為AB 8/13細胞的工作濃度。

1.4慢病毒感染AB 8/13細胞的最佳感染條件和MOI的篩選①實驗分組：為了篩選出AB 8/13細胞的最佳感染條件和MOI值，將實驗分為以下幾組：含慢病毒的完全培養基組（M組）、含慢病毒和感染增強劑HiTransG A的完全培養基組（A組）、含慢病毒和感染增強劑HiTransG P的完全培養基組（P組）、不含慢病毒和感染增強劑的完全培養基組（Control組）。②AB 8/13細胞感染：使用完全培養制備2 mL濃度為5×10⁴個/mL的AB 8/13細胞懸液，將細胞懸液以100 μL鋪板于96孔板的12個孔，在33℃、5% CO₂培養箱中將細胞培養到匯合度達20%～30%。從冰箱中取出慢病毒，并使用不含抗生素的完全培養基將慢病毒滴度稀釋為1×10⁶TU/mL、1×10⁷TU/mL、1×10⁸TU/mL，各50 μL。丟掉各孔培養基，按照表2向各孔加入不同滴度慢病毒、感染增強試劑、完全培養基。在慢病毒感染AB 8/13細胞12 h后更換新的完全培養基繼續培養，期間可以根據細胞狀態更換培養基。③感染效果確定：在慢病毒感染AB 8/13細胞72 h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞的感染效率和細胞狀態。將感染效率在80%左右、使用慢病毒最少、AB 8/13細胞狀態良好的感染條件和MOI選做正式感染的條件。

1.5慢病毒正式感染實驗及細胞穩定株的篩選①實驗分組：實驗分為5組，即加入LV-has-miR-155慢病毒和感染增強劑的完全培養基組（LV-has-miR-155組）、加入LV-has-miR-155 nc慢病毒和感染增強劑的完全培養基組（LV-has-miR-155 nc組）、加入LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒和感染增強劑的完全培養基組（LV-has-miR-155-5p inhibiton組）、加入LV-has-miR-155-5p inhibiton nc慢病毒和感染增強劑的完全培養基組（LV-has-miR-155-5p inhibiton nc組）、不含慢病毒和感染增強劑的完全培養基組（Control組）。②正式感染實驗：使用完全培養基制備5×10⁴個/mL的細胞懸液，將1 mL細胞懸液鋪板于12孔板，共10個孔，每組2孔，在33℃、5% CO₂培養箱中培養細胞24 h。然后根據分組、最佳感染條件、MOI向每孔加入總體積為500 μL的完全培養基，培養基里包含20 μL 25×HitransG感染試劑和慢病毒液。計算公式：病毒體積=（MOI×細胞數目）/病毒滴度。接著繼續在培養箱中培養12 h，中途可以根據AB 8/13細胞的生長狀態更換培養基。在慢病毒感染72 h后，于熒光顯微鏡下觀察細胞的感染效率。③穩定株篩選：在慢病毒感染AB 8/13細胞72 h后，將培養基更換為含工作濃度嘌呤霉素的培養基，每3天更換一次。在顯微鏡下觀察到Control組細胞被嘌呤霉素殺光而實驗組無細胞出現死亡（熒光效率達到100%）時，將含工作濃度嘌呤霉素的完全培養基的濃度降為1/4，繼續對感染的AB 8/13細胞進行增殖和篩選。然后收集細胞進行qPCR鑒定，確實是否為過表達和敲低的AB 8/13細胞株。9F60236C-D85B-47C2-8353-F753D7AE81E8

1.6實時熒光定量PCR（qPCR）檢測AB 8/13細胞的miR-155表達量通過Trizol法提取各組AB 8/13細胞的RNA，然后使用超微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度，并通過瓊脂糖凝膠電泳測定所用RNA是否降解。按說明書取2 μg總RNA進行逆轉錄。通過LightCycler96測定miR-155、U6的表達。采用2^-△△CT法計算miR-155的相對表達量。

1.7統計學方法使用SPSS 20.0統計學軟件進行分析，數據以均數±標準差（±s）表示，多個樣本間使用單因素方差分析，其中兩兩相比采用LSD法。檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2結果2.1嘌呤霉素處理AB 8/13細胞后的死亡情況將AB 8/13細胞鋪板于24孔板，待細胞匯合度達80%左右，各培養孔更換為含不同嘌呤霉素濃度的培養基;繼續培養48 h后，在顯微鏡下觀察細胞。可見隨著嘌呤霉素濃度增加，AB 8/13細胞死亡越來越明顯，在濃度達到3.5 μg/mL及以上時可見所有細胞都被殺死（圖1）。

2.2LV-has-miR-155和LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒最佳感染條件及MOI將AB 8/13細胞鋪板于96孔板，按不同條件加入相應的轉染試劑和陰性對照慢病毒，在感染72 h后，于熒光顯微鏡下觀察結果。在過表達miR-155陰性對照慢病毒感染人足細胞中，當M組、A組、P組的MOI為1時，少許細胞被感染，帶有熒光;當M組、A組、P組的MOI為10時，各組被感染足細胞增多，P組被感染足細胞較其他兩組多，足細胞效率在80%左右，細胞生長狀態良好，其他兩組感染效率未達到80%;當M組、A組、P組的MOI為100時，各組被感染足細胞最多，感染效率接近100%（圖2）。在敲低miR-155陰性對照慢病毒感染人足細胞中，當M組、A組、P組的MOI為1時，極少數足細胞被感染;當M組、A組、P組的MOI為10時，被感染足細胞稍微增多，感染效率遠不及80%;當M組、A組、P組的MOI為100時，被感染足細胞明顯增多，感染效率在80%以上，在P組足細胞狀態變差，有少許細胞死亡（圖3）。最佳感染條件和MOI的選擇原則：①在細胞狀態不受影響的條件下盡量使用最少量的慢病毒;②細胞感染效率在80%左右。根據上述原則，LV-has-miR-155慢病毒感染AB 8/13細胞的最佳感染條件是在含HiTransG P的完全培養基中進行感染，MOI為10;LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒感染AB 8/13細胞的最佳條件為在含HiTransG A的完全培養基中進行感染，MOI為100。

2.3LV-has-miR-155慢病毒感染的AB 8/13細胞株miR-155的表達量在含HiTransG P的完全培養基中加入MOI為10的LV-has-miR-155慢病毒，感染AB 8/13細胞72 h后，使用工作濃度嘌呤霉素篩選出穩定株。熒光顯微鏡結果顯示AB 8/13-LV-has-miR-155細胞株生長狀態良好，感染效率為100%（圖4）。使用穩定株提取總RNA進行qPCR，結果顯示與Control組（1.00±0.00）比較，LV-has-miR-155組的miR-155表達量（56.66±2.50）顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01），LV-has-miR-155 nc組的miR-155表達量（1.01±0.03）無明顯變化（圖5）。

2.4LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒感染的AB 8/13細胞株miR-155的表達量在含HiTransG A的完全培養基中加入MOI為100的LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒，在感染細胞72 h后，使用工作濃度嘌呤霉素篩選出穩定株。熒光顯微鏡結果顯示AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton細胞株生長狀態良好，感染效率為100%（圖6）。使用穩定株提取總RNA進行qPCR，結果顯示與Control組（1.00±0.00）比較，LV-has-miR-155-5p inhibiton組的miR-155表達量（0.57±0.04）降低，差異有統計學意義（P<0.01），LV-has-miR-155-5p inhibiton nc組的miR-155表達量無明顯變化（1.0±0.11）（圖7）。

3討論

足細胞是腎臟的一種固有細胞，其黏附于腎小球基底膜，與基底膜、血管內皮細胞一起構成一道濾過屏障，參與腎小球過濾功能。當足細胞受到多種損傷刺激傷害后，如高血糖、阿霉素、血管緊張素Ⅱ等，可經歷一系列變化，這些變化有肥大、自噬、去分化、間質細胞轉化、脫落、死亡[6]。以上變化引起了足細胞結構和功能受損，從而可以引起和加重多種腎臟疾病，如狼瘡性腎炎、微小病變腎病、FGSG、膜性腎病、糖尿病腎病等[4]。

miRNA是一類可以調控基因表達的非編碼RNA，在病理生理過程和疾病的發生發展中都起著重要的調節作用。miRNA-155是一種重要的miRNA，與多種腎臟疾病的致病過程密切相關。有研究顯示，miRNA-155可能通過抑制CXCR5-ERK信號通路來抑制系膜細胞增殖和TGF-β1的產生，從而參與狼瘡性腎炎的致病過程[7]。ZHOU等[1]研究表明，在糖尿病大鼠的腎臟和高糖處理的腎小球系膜細胞中miRNA-155高表達，并且其可以通過TNC/TLR4/NF-κB/miR-155-5p炎癥環調控糖尿病腎病的炎癥反應和纖維化。ZHANG等[8]研究發現，在I/R誘導的AKI大鼠模型中miRNA-155被上調，miR-155可能通過調節TCF4 /Wnt/β-Catenin途徑改善急性腎損傷。本課題組前期研究表明miR-155參與了TGF-β1誘導的足細胞損傷[5，9]。我們近期的研究發現，在LPS+ATP誘導的人足細胞焦亡中miR-155被上調。WANG等[10]研究顯示，在高糖處理的足細胞中miRNA-155高表達，其可以通過抑制SIRT1導致足細胞損傷，增強足細胞釋放炎癥因子。多個研究顯示miRNA-155可以調控巨噬細胞、心肌細胞和腎小管細胞的焦亡過程[11～13]。綜上，我們推測miR-155可能通過調節足細胞焦亡參與腎臟疾病的病理生理過程。為了進一步探究miR-155在足細胞焦亡中的具體作用機制，需要過表達和敲低足細胞miR-155的表達量。9F60236C-D85B-47C2-8353-F753D7AE81E8

慢病毒是毒性基因被剔除并被外源性基因替代的重組慢病毒載體HIV-1，其具有良好的感染特性，既可以感染分裂細胞也可以感染非分裂細胞。慢病毒常被用于基因過表達與敲低的一種工具，通過把自身攜帶的外源基因或干擾基因整合到目的細胞染色體上，從而實現對目的基因持續穩定地過表達或敲低[14]。本實驗通過LV-has-miR-155和LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒的陰性對照病毒分別感染AB 8/13細胞，確定了過表達和敲低miR-155慢病毒的最適感染條件;通過不同濃度嘌呤霉素對AB 8/13細胞損傷的情況，確定AB 8/13細胞嘌呤霉素工作濃度。根據LV-has-miR-155和LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒最適感染條件對足細胞進行感染，用嘌呤霉素進行篩選，獲得過表達和敲低miR-155的AB 8/13細胞株。經實時熒光定量PCR驗證，與正常AB 8/13細胞相比，miR-155過表達的AB 8/13穩定株miR-155表達量顯著升高，miR-155低表達的AB 8/13穩定株miR-155表達量顯著降低。因此，我們成功獲得了miR-155過表達的AB 8/13穩定株和miR-155低表達的AB 8/13穩定株。

我們前期研究顯示miR-155在LPS+ATP誘導的足細胞焦亡中高表達，表明miR-155參與足細胞焦亡。在接下來的研究中，我們將尋找miR-155的下游靶標蛋白，探討miR-155表達變化對細胞焦亡和下游靶標蛋白的影響，雙熒光素酶報告實驗驗證miR-155與下游蛋白的靶向關系，了解miR-155通過何種通路調控足細胞焦亡，進而為慢性腎臟疾病的防治提供新的理論依據和治療靶點。參考文獻[1] ZHOU Y，MA X Y，HAN J Y，et al.Metformin regulates inflammation and fibrosis in diabetic kidney disease through TNC/TLR4/NF-κB/miR-155-5p inflammatory loop[J].World J Diabetes，2021，12（1）：19-46.

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（收稿日期：2021-11-07修回日期：2022-04-18）

（編輯：潘明志）9F60236C-D85B-47C2-8353-F753D7AE81E8