PCR技術在食品微生物檢測中的作用分析

孟慶輝 唐桂華

食品安全是社會大眾關注的熱點問題，也是世界公認的解決難度最大的公共衛生問題。近年來，隨著經濟水平大幅度提升，人民的物質生活和以往相比得到大幅度改善，對食品安全也提出了更高的要求，如何提升食品微生物檢測成效和質量已成為當前食品安全工作發展的趨勢。常見致病菌包括副溶血性孤菌和沙門氏菌等，高效檢測上述致病菌能切實保障食品安全。但做好上述工作需要成熟的檢測技術。PCR（聚合酶鏈式反應）以操作便利、快速以及靈敏等優勢在食品微生物檢測中得到廣泛應用，該技術還可鑒定細菌抗原結構，以及檢測原理明確食品微生物情況。本文基于PCR技術分析其微生物檢測具體應用，望給予食品檢測人員以及相關研究者提供參考。

一、PCR概述

（一）基本原理

PCR是一種具有選擇特性的且在體外對DNA或RNA片段擴增方式，其反應原理基本類似于細胞內DNA復制。然而PCR反應體系相較于細胞內的DNA復制更為簡單，主要涵蓋四種dNTP、緩沖液體系、耐熱DNA聚合酶、DNA靶序列及其DNA靶序列單鏈3末端行互補的合成引物。PCR由低溫退火、高溫變性、適溫延伸三個反復熱循環步驟組成。其中低溫退火即模板DAN會通過變性分解至兩條單鏈，該單鏈經引物退火、降低溫度以及與互補DNA模板相結合后形成局部雙鏈，由此形成DNA復制起點。高溫變性即在95℃的高溫環境中，雙鏈DNA模板造成氫鏈斷裂，進而分離雙鏈后形成單鏈DNA，也稱之為變性。經變性的單鏈可在此結合且能同時恢復性質。適溫延伸即當模板與引物相結合后受DNA多聚酶作用影響，從引物5端延伸至3端，與模板互補的DNA鏈由此合成，DNA含量經上述循環后增加1倍。

（二）基本成分

PCR反應的主要成分有以下組成：核苷酸引物（一對）、模板DNA、三磷酸脫氧核苷酸（四種）、耐熱DNA聚合酶、緩沖液、部分離子。其中模板即需擴增序列的核苷酸，PCR反應模板可由所有形式的RNA與DNA組成。引物即將靶DNA3端與5端異性相結合的核苷酸片段，PCR特異性由上述片段決定。緩沖液即維持PCR反應pH，廣泛應用的Tris-HCl在10-50mol/L范圍內，pH變化在PCR反應中的6.8-7.8。耐熱DNA聚合酶即保證PCR自動化實現，該物質可承受95℃以上高溫且不會喪失原有活性。三磷酸脫氧核苷酸，即PCR反應原料為dGTP、dTTP、dATP、dCTP三磷酸脫氧核苷酸。除dNTP溶液pH為7.0外，其他dNTP濃度均在2.5mmol/L間，通常使用濃度控制在20-200umo/L，為降低錯配發生率，需保證各個dNTP分子濃度相等。

（三）反應系統組成

PCR反應系統由TaqDNA聚合酶的量、PCR緩沖液、石蠟油、模板以及四種脫氧三磷核苷酸組成。

（四）優勢

1.操作便捷簡單

以往在檢測食品微生物時多以自動化檢測技術為主，經長期實踐發現，傳統檢測技術檢測時間長，整體檢測準確性與檢測效率偏低，工作人員任務繁重。PCR檢測技術是科學技術發展中延伸而出的高自動化檢測技術，運用PCR技術和相應的檢測程序即可檢測食品多種微生物，一人可獨立完成檢測工作，操作簡單且系統自動化程度高，最重要的是檢測時效性佳、效率高，為食品衛生安全提供基本技術支持的同時，推動了食品微生物檢測工作的迅速發展。

2.檢測效率高

以往食品微生物檢測花費的檢測周期為2-4d，若檢測種類較多則需7d完成。再加上大部分食品為保質期較短的即食性食物，部分商家未等到食品微生物檢測結果就直接銷售，造成食品微生物檢測滯后現象嚴重。若發現食品衛生安全問題則會召回已銷售食品，在此過程中極有可能發生食品安全事故，造成不可預估的經濟和品牌口碑損失。PCR檢測效率高，通常只需數小時就可完成對食品微生物的檢測，結果出示時間為1d左右。

3.檢測準確率高

由于分離培養、生化鑒定等傳統檢測方式在檢測食品微生物時面臨的困難較多，進而降低檢測準確率，不利于對食品微生物種類及其產生的危害性進行準確辨別。PCR技術在現代食品微生物檢測中發揮著不可小覷的作用，該技術可同時對多種食品微生物進行檢測，且能運用先進的PCR技術準確辨別微生物種類及其危害性，保證食品衛生安全的同時，使食品微生物檢測準確率得到大幅度提升。

（五）影響因素

影響PCR的因素共有以下幾個方面：①引物設計。通常需運用統計學計算引物長度，要求引物組成與CG%含量比例平均，盡可能防止引物內部形成顯著次級結構。②溫度循環參數。參數由循環次數、引物退火溫度、引物延伸溫度以及模板變性溫度等組成。③擴增平坡。當擴增歷經相應的循環周期后，需擴增片段則進入平坡循環次數，并非根據不斷增多的隨指數進入平坡，上述現象與已有的模板拷貝數與合成DNA總量有關。所謂平坡即PCR循環后期，當合成產物達至0.3-1pmol時，原有基于指數增加的速率會因堆積的產物變成平坦。導致PCR進入平坡因素多以已消耗完畢的引物與dNTP及Taq酶失去活性等有關。④PCR特異性。緩沖液濃度改變、酶與引物濃度降低、簡短退火與退火溫度時間及避免模板已有的次級結構等。⑤DNA聚合酶選用。第二段耐熱DNA聚合酶Stoffel片段、RTth逆轉錄酶、TaqDNA聚合酶等。

二、PCR技術在具體應用中的測定方式

PCR技術因自身表現優異，進而廣泛應用于現代食品檢測工作。例如，食品檢測中常見的大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌均能經PCR技術檢測。例如，金黃色葡萄球菌會迅速在蔬菜和水果中繁殖，若長期存放蔬菜水果則會導致大量繁殖的金黃色葡萄球菌出現在果蔬表面。金黃色葡萄球菌的代謝產物腸毒素會嚴重損傷人體，若情況嚴重則會導致食用者中毒，故而在檢查食品時需科學檢查類似菌，消除細菌對人體造成的危害。PCR技術可檢測食物樣品微量元素與相關物質且具有較高的檢測精度。食品生產企業在食品出廠前運用PCR技術檢驗可有效避免市場流入非合格食品。在檢測過程中通過標記特定蛋白以及檢測蛋白，獲取檢測微生物含量。當前在食品微生物檢測中廣泛應用PCR技術，可有效檢測不同的被檢測菌，大幅度提升檢測準確率。

（一）常規PCR檢測法

食品微生物的常用檢測方式即常規PCR檢測法，即將測定目標物質中的DNA模板和及其反應產生的引物相混合。在檢測中將一定量的聚合酶加入混合后的混合物中，就可制作基本檢測樣本。在后續檢測中還需在特定反應條件與溫度下開展培養反應活動。添加聚合酶的混合物在適合溫度環境下受聚合酶作用影響，引領目標物質行電腦模板序列下擴增，模板DNA片段經多個周期后會持續進行復制與擴增。與此同時，在檢測中，測定目標物上所具有的DNA能直接反映被檢測食品在相應時間中形成的微生物數量與種類。以往檢測方式即通過DNA復制與擴增能力將少量且潛在微生物群轉至可觀性較強的微生物群，達到檢測食品微生物的目的。

（二）多重PCR檢測法

多重PCR檢測法是對常規PCR檢測法的調整與創新。如果說常規PCR技術在檢測中運用單引物，那么多重PCR檢測技術則運用多個DNA引物檢測。例如，將兩個或兩個以上反應引物添加至同一PCR反應體系，上述引物需在聚合酶作用下持續復制與擴增。由于在反應前添加多個DNA引物，經聚合酶反應后可獲取多個不同的DNA反應片段，故而多重PCR檢測方式可測定分析微生物的多個致病菌，使檢測效率與準確率得到大幅度提升。多重PCR檢測技術與傳統PCR檢測法相比可分析出更多的致病因子，防止在檢測中發生遺漏被檢測菌現象，使檢測更為嚴謹。對此，在食品微生物檢測中，除檢測特殊致病菌外，運用多重PCR檢測法可檢測食品微生物，避免發生遺漏檢測內容，縮短檢測時間，減少工作人員負擔，切實提升食品微生物的檢測準確率。此外，多重PCR檢測法投入的樣本相對較少，經濟效益高，可檢測多個基因。

（三） PR-PCR檢測法

PR-PCR檢測是常規PCR檢測法的變形形式，雖不同于常規檢測法，然而該檢測技術在檢測食品微生物中有顯著優勢。該檢測技術原理，即提取細胞或組織中的總RNA并以mRNA作為模板，運用隨機引物或01igo和逆轉錄酶反轉錄形成cDNA。同時，基于cDNA模板行PCR擴增，由此獲取檢測基因或目的基因表達。與常規PCR檢測方式相比，PR-PCR檢測對檢測目標物中的一條RNA行逆轉錄，之后就會產生互補DNA并基于此行復制與擴增。應用該檢測技術需明確的是，逆轉錄DNA模板處于完整狀態且不含任何蛋白質或雜質，保證基因鏈完整。在檢測食品微生物時可應用于微生物檢測定量分析，如將數字技術與熒光技術相結合的PCR檢測，通過定量分析測定目標中的微生物后再行檢測，可有效保證檢測中高靈敏性，更能獲得準確檢測結果。所以，運用PR-PCR檢測法檢測食品微生物可針對性地對微生物進行檢測，保證高精準度的檢測結果。

三、PCR技術在食品微生物檢測中的應用

（一）應用PCR技術檢測海產品中的副溶血性弧菌

海產品中常見的細菌種類即副溶血性弧菌，人類一旦食用含有副溶血性弧菌的海產品則會引發急性腸胃炎，所以副溶血性弧菌是最為重要的食源性疾病病原菌類型。相關研究指出，副溶血性弧菌在沿海國家與地區的海產品中具有相對嚴重的污染率，其中軟體類、甲殼類、貝類、魚類等海產品有著較高的檢出率，受污染程度與海域環境條件、海產品類別等有著緊密聯系。綜觀近年來的檢測結果得知，淡水產品發生副溶血性弧菌的概率呈顯著上升趨勢，且具有季節性、多環節與多物種等高污染特征。當前檢測食品中副溶血性弧菌多采取快速檢測法與傳統檢測法，使用率最高的則為傳統副溶血性弧菌檢測法，因檢測便利且價格低廉受到歡迎，然而該檢測方式靈敏度低且耗費大量時間。隨著科學技術的快速發展，針對食品中的副溶血性弧菌檢測也有所創新，很多科技企業相繼推出如PCR-探針法（副溶血性弧菌核酸檢測試劑盒）等特異性強、便利且迅速的檢測方式，對提升檢測效率和質量方面有著重要現實意義。相關研究文獻指出，目前有22種快速檢測食品中的副溶血性弧菌方式，如基于分子生物學的PCR-變性高效液相色譜法、基于細菌培養與生化鑒定的顯色培養激法、基于噬菌體特異性的噬菌體鑒定技術、基于免疫學為基礎的免疫膠體金技術法、基于信號轉換與生物識別的生物傳感器技術、基于單克隆抗體與細胞分子水平的流式細胞術。

（二）應用PCR技術檢測生鮮食品食源性病原微生物

所謂生鮮食品即尚未對食物進行加工或初步簡單加工即可食用的食品，如果蔬、肉制品、水產品等。運用多重PCR技術檢測生鮮食品可有效改變傳統檢測技術存在的不足。一般多重PCR技術針對不同類型病原微生物的特異性與明暗性較高，且在檢驗非活菌時展現的檢測效果更為顯著，避免出現假陰性結果。相關研究者運用多重PCR技術可在4h內檢測近6種食源性病原微生物。相關研究者所研究的巢式PCR檢測引物靈敏度高出常規PCR檢測靈敏度近1萬倍，提示在檢測生鮮食品食源性病原微生物中應用多重PCR技術效果顯著。

（三）應用PCR技術檢測大腸桿菌

大腸桿菌也稱為大腸埃希氏菌，該病菌在一定條件下可引起多種動物與人發生尿道、胃腸道等多種局部組織器官感染。大腸桿菌屬于寄居在動物腸道中的病菌，有一小部分受相應條件影響而引發疾病。與此同時，大腸桿菌的血清型會引發動物或人體腸道感染，多由特定的致病性毒素與菌毛抗原等感染引發。除典型的腸道感染，還會引發腦膜炎、關節炎、尿道感染以及敗血型感染等疾病。當前人類廣泛關注對食品中的大腸桿菌的快速準確檢測，常用濾膜法、發酵法、平板計數法、ATP生物發光法、自動化儀器檢測法等，由于大腸桿菌具有毒性且具有一致性，部分檢測方式在準確率方面存在不足。在微生物檢測中應用PCR技術則為檢測大腸桿菌中的DNA雙鏈，經PCR技術于免疫磁分離技術相結合使大腸桿菌的檢測準確率得到大幅度提升，對保障食品安全有著重要現實意義。

（四）應用PCR技術檢測乳制品沙門氏菌

乳制品質量把控是食品安全管理的重要組成部分，若在生產乳制品中未合理應用生產環境控制技術，則會導致乳制品中寄存具有感染性質的病原微生物。常規乳制品檢測方式為培養微生物后運用生化反應檢測，但整體檢測速度慢且準確率偏低。運用PCR技術檢測乳制品中的沙門氏菌可使特定目標物片段得到擴增，再經Mg2+催化TaqDNA聚合酶，提升其活化性能，達到片段擴增目的。相關研究者指出，運用基于免疫磁珠技術于PCR檢測技術的PCR檢測+磁珠富集檢測乳制品沙門氏菌準確率高，操作便利，更為解決食品檢測前的時間縮短問題提供了解決路徑。相關學者在監測復合調味料沙門氏菌中根據國際標準檢測法增加細菌再行涂布XLD與BS平板，基于沙門氏菌特定序列設計相關引物，篩選出疑似菌落后測試菌液PCR反應，不僅縮短了檢測沙門菌的時間，更大幅度提升了檢測準確率和效率。

結語

總之，食品安全是重要的民生問題，雖然相關部門加大了對食品安全管理的力度，然而，群體性食品安全事件仍時有發生。借助現代技術可使食品微生物檢測效率與準確率得到大幅度提升，迅速判斷食品問題原因，為高效解決食品安全事件奠定基礎。本文研究分析的PCR技術在食品微生物檢測中以便利、高效等優勢得到青睞。在未來發展中，PCR技術會逐漸普及并廣泛應用于食品微生物檢測，并與現代科學技術熱點之一的數學技術相結合，進一步提升食品檢測質量，保障食品安全，推動食品檢測的高效有序發展。