開菲爾粒中微生物對苯并（α）芘的非靶向代謝組學 分析

古麗加馬力·艾薩 邢軍 李安 張瑞

（1. 新疆特殊環(huán)境物種保護與調(diào)控生物學實驗室 新疆師范大學生命科學學院，烏魯木齊 830054；2. 新疆大學生命科學與技術學院， 烏魯木齊 830000）

開菲爾粒（Kerfir grains）是傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品——開菲爾（kefir）的發(fā)酵劑，其主要成分除黏性多糖（由半乳糖和葡萄糖構成）外，還有大量的水和少量蛋白、脂質(zhì)等成分［1-2］。本研究團隊前期研究表明新疆傳統(tǒng)發(fā)酵劑開菲爾粒在屬水平上的發(fā)酵優(yōu)勢細菌主要有乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、芽胞桿菌屬（Bacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和奈瑟氏菌屬（Neisseria）等［3］，微生物的相互適應和協(xié)同作用聚集成了復雜的菌相，使開菲爾粒形成了整體“戰(zhàn)斗力”，能夠抑制雜菌和致病菌的溢生，特有的黏多糖能夠保護開菲爾粒不受外界微生物侵染［4-5］，使其具有很強的環(huán)境適應能力和抗污染能力，因此開菲爾?？梢宰鳛橐粋€相對較為穩(wěn)定的生物反應器［6-7］。開菲爾發(fā)酵乳制品具有較高的營養(yǎng)價值，含有消化性很高的乳蛋白質(zhì)和乳脂肪。蛋白質(zhì)中水溶性氮和氨基酸含量高，發(fā)酵過程中基本無損失；脂肪球能夠充分乳化，更易消化吸收，游離脂肪酸和揮發(fā)性脂肪酸含量高，風味良好。另外開菲爾由于多種有益微生物菌相作用使產(chǎn)品的營養(yǎng)比原乳有了很大提高，且易于消化，成為具有豐富營養(yǎng)的保健食品［8-11］。

苯并（a）芘分子量較大，由5個苯環(huán)組成，結(jié)構穩(wěn)定，難溶于水。環(huán)境和食品中的苯并（a）芘，雖然可以通過一些物理、化學方法降解和清除，但易帶來二次污染，且成本較高，而生物降解是非常重要和有效的措施，具有經(jīng)濟、安全、方便的特點，其中最為關注的是微生物降解研究，并已取得了一定成績［12-16］。有研究表明，能夠降解苯并（a）芘的微生物，主要歸屬于分枝桿菌屬（Mycobacterium）和假單胞菌屬（Pseudomonas），它們大多來自被污染的水體、土壤、海洋及其沉積物［17-19］。Zhao等［20］研究了乳酸菌菌株對苯并（α）芘的結(jié)合能力發(fā)現(xiàn)， L. plantarum CICC 22135和 L. pentosus CICC 23163菌株的結(jié)合率分別為66.76%和64.31%。Zhang［21］等人發(fā)現(xiàn)了乳酸菌具有去除在淀粉基食品中苯并（α）芘的潛在能力。

新疆地區(qū)少數(shù)民族自古以來就有制作和食用發(fā)酵乳制品的習慣，經(jīng)過幾千年的馴化，這些傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中保留了許多具有傳代性好，抗逆性強，風味濃郁獨特對人體健康有益的乳酸菌及其它微生物菌群［22-24］。本文針對傳統(tǒng)發(fā)酵劑開菲爾粒中微生物對多環(huán)芳烴類化合物苯并（α）芘的作用機制這一問題，研究在苯并（α）芘脅迫作用下，開菲爾粒微生物在發(fā)酵乳中代謝產(chǎn)物發(fā)生的特征性變化，采用非靶向代謝組學技術［25-26］，結(jié)合主成分分析和偏小二乘判別分析方法，尋找特征代謝產(chǎn)物，在KEGG數(shù)據(jù)庫中注釋特征代謝物參與可能的代謝途徑，進而推導出開菲爾粒中微生物對苯并（α）芘降解的可行代謝物通路。研究可以為微生物對苯并（α）芘的作用機制提供一定的理論基礎，為降低苯丙（a）芘對人體的危害提出可能的生物防治策略，進而為開菲爾發(fā)酵乳制品在食品工業(yè)中的合理開發(fā)應用提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 采集新疆阿勒泰地區(qū)牧民家庭手工制作的開菲爾發(fā)酵乳制品，采集后裝入滅菌自封袋中冷凍保藏運送至實驗室。

1.1.2 主要試劑 苯并（α）芘（分析純，＞96%）購自上海麥克林生化科技有限公司，甲醇、乙腈（均為色譜純，≥99.9%）購自美國Thermo Fisher Scientific公司，甲基叔丁醚（分析純，≥99.9%）：購自北京沃凱生物科技有限公司，甲酸銨（分析純，≥99.9%）購自自美國 Sigma-Aldrich 公司，甲酸、丙酮、ddH2O等試劑均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 開菲爾粒的活化與開菲爾乳的制備 取適量開菲爾發(fā)酵乳制品加入無菌水輕輕搖晃，清洗，過濾后留下傘狀開菲爾粒備用。將清洗后的開菲爾粒按1∶5的質(zhì)量比加入到滅菌牛乳中，在（37±1）℃培養(yǎng)24 h，重復上述活化步驟活化1-2次，備用。

苯并（α）芘溶液的配置：將苯并（α）芘固體溶于丙酮中配制為1 mg/mL的苯并（α）芘貯備液，然后用水稀釋為苯并（α）芘濃度為100 μg/mL的工作液。

1.2.2 樣品制備及處理 樣品制備：將牛奶在80-82℃下加熱20 min后冷卻至40℃，然后以2%的接種量添加已活化的開菲爾粒，取剛接種開菲爾粒的牛乳為發(fā)酵0 h的樣品作為對照樣；在發(fā)酵乳中添加苯并（α）芘儲備液，使其濃度為50 μg/mL，樣品在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，從發(fā)酵8 h起每隔8 h取5個平行樣，直到發(fā)酵32 h共25份樣本，分別 編 號 為KBD001、KBD002…KBD005，KBD081、KBD082…KBD085，KBD161、KBD162…KBD165，依此類推，-80℃保藏備用。

發(fā)酵樣品的前處理：將所有樣本在4℃下融化（樣品量不足按照等比例縮減）；從每個樣本中取150 μL 于1.5 mL 離心管中；每個離心管加入200 μL 甲醇和200 μL 甲基叔丁基醚（MTBE），振蕩60 s，充分混勻；在12 000 r/min 4℃ 離心10 min，上清液使用0.22 μm 膜過濾，得到待測樣本；自每個待測樣本各取20 μL 混合成QC樣本（QC：quality control，用來校正混合樣品分析結(jié)果的偏差以及由于分析儀器自身原因所造成的失誤）。

1.2.3 LC-MS分析 色譜條件：儀器采用Thermo Ultimate 3000，使用ACQUITY UPLC? HSST3 1.8 μm（2.1 mm×150 mm）色譜柱，自動進樣器溫度設為8℃，以0.25 mL/min 的流速，40℃的柱溫，進樣2 μL 進行梯度洗脫，流動相為正離子0.1%甲酸水（C）- 0.1%甲酸乙腈（D）；負離子5 mmol/L 甲酸銨水（A）-乙腈（B）。梯度洗脫程序為0-1 min，2% B/D；1-9 min，2%-50% B/D；9-12 min，50%-98% B/D；12-13.5 min，98% B/D；13.5-14 min，98%-2% B/D；14-20 min，2% D -正模式（14-17 min，2% B -負 模式）。

質(zhì)譜條件：儀器使用Thermo Q Exactive Focus，電噴霧離子源（ESI），正負離子電離模式，正離子噴霧電壓為3.50 kV，負離子噴霧電壓為2.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣 10 arb。毛細管溫度325℃，以分辨率70 000 進行全掃描，掃描范圍81-1 000，并采用HCD 進行二級裂解，碰撞電壓為30 eV，同時采用動態(tài)排除去除無必要的MS/MS信息。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 所有的LC-MS圖譜使用R（v3.1.3）的XCMS程序包進行峰識別、峰過濾、峰對齊得到包括質(zhì)核比（mass to charge ratio，m/z）和保留時間及峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣，進而得到正負離子模式下的前體分子，導出數(shù)據(jù)至R語言statTarget包的QC-RFSC算法對各個樣本的特征（每個代謝物）信號峰進行校正，使用R2和Q2進行主成分分析（principal components analysis，PCA）和最小二乘法判別分析PLS-DA（Partial Least Squares Discriminant Analysis），根據(jù)t檢驗的P ＜0.05，同時 PLS-DA 模型主成分的VIP 值＞1，進行差異性代謝物的篩選。對篩選出的差異代謝物，通過KEGG Pathway 數(shù)據(jù)庫通路分析代謝物參與代謝途徑，推導出苯并（α）芘降解的代謝物通路。

2 結(jié)果

2.1 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段的開菲爾代謝物主成分分析（PCA）

采用PCA分析對苯并（α）芘脅迫下的5個不同的發(fā)酵時間段的開菲爾樣品進行PCA分析，結(jié)果見圖1。5個分組的點云（point cloud）明顯分布在不同區(qū)域，從總體上反映了各組樣品之間的總體差異和組內(nèi)樣品之間的變異度大小，5組不同發(fā)酵時間段的樣品組的平行樣品聚在一起，表明所有檢測具有良好的分析穩(wěn)定性和實驗重現(xiàn)性；同時，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）解釋率分別為39%和14%，兩者累計貢獻率達到53%，可見苯并（α）芘脅迫條件下不同發(fā)酵時間內(nèi)開菲爾樣品之間分離趨勢較明顯，從整體上反映出這些樣品之間的代謝物差異。A組未添加苯并（α）芘的對照樣品與其他樣品代謝物之間存在明顯分離，可能是在苯并（α）芘脅迫下開菲爾粒中微生物產(chǎn)生的謝物物所導致的。

圖1 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段樣品主成分分析Fig. 1 Principal component analysis of the samples at different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress

2.2 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段的開菲爾代謝物PLS-DA分析

偏最小二乘判別分析是有監(jiān)督的，即分析時需要提供分組信息，能夠?qū)ふ易畲蟪潭葏^(qū)分樣品分組的因子（因子可以理解為所有代謝物的加權和）。如圖2，不同分組的樣本的點云分布在不同區(qū)域，說明PLS-DA模型的判別效果較好，分組間應該存在有顯著差異的代謝物，其結(jié)果與PCA相似，正離子模式下所構建模型對開菲爾代謝物的累積判別解釋能力R2Y=0.997，對模型預測能力Q2=0.971，這兩個指標越接近于1時表示模型越穩(wěn)定可靠，模型的擬合度較好。在OPLS-DA的置換檢驗中，我們用Q2作為檢驗統(tǒng)計量，用置換的方法求得Q2的隨機分布。如圖3，如果箭頭所指的實際觀測Q2在隨機分布右側(cè)（觀測值明顯大于隨機值），說明Q2是顯著的，模型的預測能力顯著。

圖2 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段段樣品PLS-DA得分圖Fig. 2 PLS-DA score map of samples at different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress

圖3 OPLS-DA置換檢驗的檢驗統(tǒng)計量（Q2）分布以及 P值Fig. 3 Distribution of the test statistic（Q2）of the OPLSDA substitution test and the P value

2.3 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段的開菲爾代謝物

計算每個樣本內(nèi)各個代謝物的百分比含量，然后用堆積柱形圖可視化，能直觀的比較分組之間的代謝物組成結(jié)構差異。圖4展示了含量排在前20的代謝物，橫坐標是樣品名，根據(jù)分組順序排序，同時用不同顏色標注了不同的分組樣本?？v坐標表示各個代謝物的百分比含量，從上而下對應代謝物的柱的順序與圖例一致，其余的代謝物被包括進Others中。從圖中可以看出，有機酸類物質(zhì)占主導地位，檸檬酸類物質(zhì)在發(fā)酵初期積累最多，隨著發(fā)酵時間的延長逐漸減少。發(fā)酵0 h的樣品中代謝物豐度與其他組分之間有較大差異，可能原因是發(fā)酵時間的不同與苯并（α）芘的脅迫所導致的。開菲爾粒中微生物在8 h時磷酸膽堿類物質(zhì)減少，甘油磷酰膽堿類物質(zhì)增加，苯乙胺物質(zhì)在開菲爾發(fā)酵8 h與24 h的含量較高。

圖4 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段樣品中代謝物百分比堆積柱形圖Fig. 4 Stacked histogram of the percentages of metabolites in the samples at different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress

在所有代謝物中，有的代謝物是在生物體內(nèi)扮演著特定角色的，比如激素、維生素等。我們將所有代謝物用KEGG數(shù)據(jù)庫br08001進行注釋，得到代謝物所扮演的生物學角色，然后統(tǒng)計每個生物學角色的百分比含量，繪制百分比含量堆積柱形圖，如圖5所示。開菲爾粒中微生物在經(jīng)過一系列代謝反應過程之后，中間代謝產(chǎn)物逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轭惞檀碱愇镔|(zhì)，激素和遞質(zhì)，維生素，脂類物質(zhì)，核酸類物質(zhì)，碳水化合物以及有機酸類物質(zhì)。在發(fā)酵16 h時激素和遞質(zhì)類物質(zhì)也較之前有明顯遞增。

圖5 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階樣品扮演生物學角色的代謝物百分比Fig. 5 Percentage of metabolites playing a biological role in the samples of different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress

2.4 特征代謝物（biomarker）的篩選

通過KEGG代謝物數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進行映射，為了更直接地了解關鍵代謝物，使用箱圖比較來自5個不同發(fā)酵時間段的開菲爾粒中微生物代謝產(chǎn)物的含量豐度差異，結(jié)果見圖6，顯示具有極顯著差異排名前25的物質(zhì)。結(jié)果表明，胞核嘧啶、谷胱甘肽、4-胍基丁酸、胍丁胺、2-苯基乙醇、L-色氨酸、丙二酸、鞘氨醇、N-乙?；鵇-半乳糖胺、腺苷、X1-羧基乙烯基膦酸酯、N-乙酰膽堿、腺嘌吟、N6-乙酰L-賴氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、肌氨酸、甲基丙二酸等代謝產(chǎn)物在對照組與苯并（α）芘脅迫組之間存在明顯差異。

圖6 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段樣品代謝物差異箱式圖Fig.6 Box plot of the differences in metabolites of the samples at different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress

同時為能夠?qū)ふ以谂袆e分析過程中作用（value importance in projection，VIP，重要性）最大的代謝物，將這些代謝物作為區(qū)分不同分組的biomaker。一般來說，VIP大于1的代謝物對判別分析的貢獻是較大的，這些代謝物在分組間有較大差異。如圖7黃色區(qū)域中，鄰苯二甲酸（C8H6O4）、原兒茶酸 （（HO）2C6H3COOH）與苯乙酸（C8H8O）是校正后P＜0.05，VIP大于1的代謝物，這些代謝物在分組間有顯著差異，在PLS-DA中起到重要作用。

圖7 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段樣品PLS-DA代謝物重要性圖Fig.7 Importance map of PLS-DA metabolites in the samples at different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress

如圖6、7所示，對開菲爾粒中微生物在代謝過程中產(chǎn)生的重要代謝物進行分析，結(jié)果顯示出原兒茶酸和鄰苯二甲酸雖然在含量圖中并未顯示，但在代謝物重要性中可以看出原兒茶酸與鄰苯二甲酸雖然含量不高，但在代謝過程中對代謝通路的判斷有著重要的方向引導。

結(jié)合圖1、2中PCA以及PLS-DA分析得出，在B組間明顯有差異代謝物的產(chǎn)生，實驗通過LC-MS分析，深入研究了開菲爾粒中微生物在對苯并（α）芘降解過程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，其中通過圖3、4可明顯看出在開菲爾粒中微生物在降解苯并（α）芘第8小時產(chǎn)生了苯乙酸等物質(zhì)。

2.5 降解菌代謝苯并（α）芘的途徑推測

富集分析是尋找在某個生物學過程中起關鍵作用的生物通路，從而揭示和理解生物學過程的基本分子機制。通過與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，可以獲得代謝物參與的代謝通路信息，不同發(fā)酵階段的開菲爾乳中間代謝產(chǎn)物共注釋到56條代謝通路。對于代謝組數(shù)據(jù)，在富集分析之前，需要尋找特征代謝物，通常是那些在分組間有顯著差異（t檢驗，P＜0.05）的代謝物。

為了了解苯并（α）芘脅迫下開菲爾不同發(fā)酵階段關鍵的代謝途徑，通過計算這些代謝通路的過表達分析（over-representation analysis，ORA）P值，從而判斷顯著差異的代謝物是否在這些代謝通路中顯著富集。圖8中顯示了差異代謝物顯著富集的代謝通路。這些途徑包括：精氨酸和脯氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、三羧酸循環(huán)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、嘧啶代謝、酪氨酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成等。顏色越深的通路表示這些代謝通路在重要代謝物鄰苯二甲酸、原兒茶酸以及苯乙酸在代謝過程中富集程度越大。

圖8 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段樣品差異代謝物顯著富集的代謝通路（ORA富集分析）Fig.8 Metabolic pathways with significant enrichment of differential metabolites in the samples at different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress（ORA enrichment analysis）

即便關注的代謝物在某個通路中顯著富集，目前仍然不知道這些代謝物在這個代謝通路中是否起到關鍵作用，代謝物對代謝通路究竟有多大影響。拓撲分析能夠計算顯著差異的代謝物在代謝通路中的作用大?。ㄓ肐mpact衡量）。圖9中虛線右側(cè)區(qū)域的代謝通路是ORA富集分析中顯著的代謝通路，縱坐標展示了這些代謝通路在拓撲分析中的作用大小，其結(jié)果與ORA富集分析結(jié)果一致。由拓撲分析圖顯示，原兒茶酸不僅在代謝過程中有著重要作用，同時原兒茶酸所在的這些代謝通路在苯并（α）芘降解的過程中也起到了關鍵性作用。

圖9 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段樣品差異代謝物顯著富集的代謝通路拓撲分析Fig.9 Topological analysis of metabolic pathways with significant enrichment of different metabolites in the samples at different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress

代謝通路圖能夠比較直觀的反映代謝物的上下游關系，作用模式，以及代謝通路的拓撲結(jié)構，同時能找到與代謝物關聯(lián)的基因，是同時包含代謝物和基因的代謝通路（KEGG完整的代謝通路），有顏色的代謝物是在分組間有顯著差異的代謝物，顏色對應分組，表示在對應分組中代謝物含量較高（相對其它分組）。

經(jīng)過圖8、9的代謝通路顯著性分析，結(jié)合在PCA以及PLS-DA中分析得到的差異代謝物鄰苯二甲酸、原兒茶酸、苯乙酸、鄰苯二甲酸二異丙酯和苯酚等，可推斷開菲爾粒中微生物在代謝苯并（α）芘時經(jīng)過的代謝通路，如圖10、11所示，苯乙酸在開菲爾粒中微生物降解苯并（α）芘時所經(jīng)過的一條途徑為苯丙氨酸途徑，鄰苯二甲酸由鄰苯二甲酸二異丙酯通過鄰苯二甲酸途徑代謝產(chǎn)生。

圖10 苯丙氨酸途徑Fig. 10 Phenylalanine pathway

與空白對照樣比較，開菲爾粒中微生物的代謝體系中發(fā)現(xiàn)5種物質(zhì)。分別為保留時間635.17、444.83、65.98、692.45和463.93 min的鄰苯二甲酸、原兒茶酸、苯乙酸、鄰苯二甲酸二異丙酯和苯酚。其中苯乙酸和苯酚推測為氫化肉桂酸進一步氧化代謝所產(chǎn)生，而在有氧的情況下，鄰苯二甲酸首先被轉(zhuǎn)化為原兒茶酸，接著原兒茶酸在雙加氧酶的作用下被開環(huán)，從而進一步被利用［18］；而鄰苯二甲酸推測由鄰苯二甲酸二異丙酯代謝產(chǎn)生。而鄰苯二甲酸二異丙酯的存在推測是由1-羥基-2-萘甲酸在脫氫酶、雙加氧酶、脫氫異構酶等一系列酶的作用下苯環(huán)裂解產(chǎn)生的［27］。

圖11 鄰苯二甲酸途徑Fig. 11 Phthalic acid pathway

3 討論

由于苯并（α）芘具有較強的致癌性、致突變性和致畸性，所以在研究高分子量多環(huán)芳烴的生物轉(zhuǎn)化中，主要集中在苯并（α）芘的降解領域中，馬靜等［28］研究得出假單胞菌屬（Pseudomonas）細菌是將多環(huán)芳烴化合物降解成為水楊酸和鄰苯二酚等代謝產(chǎn)物最終進入三羧酸循環(huán)；分枝桿菌屬（Mycobacterium）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、糞產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、微球菌屬（Microcoecus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）［29］，是將多環(huán)芳烴化合物代謝成為鄰苯二甲酸和原兒茶酸再進入三羧酸循環(huán)［30］。還有一些菌株同時擁有兩條甚至兩條以上的苯并（α）芘代謝路徑，如楊璐溪等［31］的研究表明新鞘氨醇桿菌US6-1以鄰苯二酚代謝路徑和原兒茶酸代謝路徑。

細菌降解苯并（α）芘的過程中，中間代謝產(chǎn)物變化快且累積少，代謝產(chǎn)物的分離難度也大，因此有些學者研究發(fā)現(xiàn)降解苯并（α）芘時出現(xiàn)的中間代謝產(chǎn)物，未能進一步研究降解途徑，只有少數(shù)研究表明，分離到苯并（α）芘代謝的中間產(chǎn)物并對其降解途徑進行了分析。Kamlesh等［32］在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis BMT4i’deki MTCC 9447）對苯并（α）芘的降解產(chǎn)物中檢測到了苯并（a）芘-11、12-環(huán)氧化物，苯并（a）芘順式7、8-二氫二醇等7種代謝產(chǎn)物，并由此推斷表明枯草芽孢桿菌中苯并（α）芘降解有多種途徑。苯并（α）芘在最初階段由氧化還原反應活化，通過氫原子的還原和飽和碳原子中的碳-碳鍵被氧化而形成1-羥基-2-萘甲酸。而1-羥基-2-萘甲酸被認為是多環(huán)芳烴生物降解的關鍵中間產(chǎn)物［27］。雖然在本研究中并未測得1-羥基-2-萘甲酸，但在許多推定芳烴雙加氧酶基因的研究可以支持這一推論［33-35］。而1-羥基-2-萘甲酸通?？梢酝ㄟ^“鄰苯二甲酸途徑”或“萘途徑”的兩種不同途徑進行降解［34］。通過已經(jīng)測得的鄰苯二甲酸經(jīng)由“鄰苯二甲酸途徑”進一步轉(zhuǎn)化為原兒茶酸［36］，推測開菲爾粒中微生物對苯并（α）芘的降解是經(jīng)過“鄰苯二甲酸途徑”代謝途徑。雖然1-羥基-2-萘甲酸通過“萘途徑”的代謝途徑可能產(chǎn)生的氫化肉桂酸并未檢出，但苯乙酸和苯酚的存在可以推斷出氫化肉桂酸為1-羥基-2-萘甲酸通過“萘途徑”代謝的降解產(chǎn)物。苯酚可以通過羥化酶基因的作用轉(zhuǎn)化成為兒茶酚進入三羧酸（TCA）循環(huán)后被降解，羥化酶基因通過編碼苯酚降解途徑的第一個酶，負責將苯酚轉(zhuǎn)化為兒茶酚；將兒茶酚開環(huán)裂解為TCA產(chǎn)物，是由鄰位和間位酶負責的；兒茶酚的進一步降解具有不同的途徑和酶系統(tǒng)：鄰苯二酚2，3-雙加氧酶（間位裂解）或鄰苯二酚1，2-雙加氧酶（鄰位裂解）［37］。苯酚也可通過羥基被氧化為羧基形成糖醛酸。通過以上分析，推測開菲爾粒中微生物在降解苯并（α）芘時具有“萘途徑”“鄰苯二甲酸途徑”“苯丙氨酸途徑”3條代謝途徑，最后進入TCA循環(huán)。研究結(jié)果表明開菲爾粒中微生物在降解苯并（α）芘方面具有較大潛力，可以為微生物對苯并（α）芘的作用機制提供一定的理論基礎，可以為降低苯丙（a）芘對人體的危害提出可能的生物防治策略，為開菲爾發(fā)酵乳制品在食品工業(yè)中的合理開發(fā)應用提供研究依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究基于LC-MS 的非靶向代謝組學技術，對添加苯并（α）芘發(fā)酵0 h、8 h、16 h、24 h和32 h 的5個發(fā)酵時間段樣品的差異代謝產(chǎn)物進行分析。通過對差異代謝物和通路進行相關性分析，獲得了鄰苯二甲酸、原兒茶酸、苯乙酸、鄰苯二甲酸二異丙酯和苯酚等特征代謝物。從以上5種物質(zhì)推測出開菲爾粒中微生物在降解苯并（α）芘時可能經(jīng)過“萘途徑”“鄰苯二甲酸途徑”“苯丙氨酸途徑”3條代謝途徑，最后進入TCA循環(huán)。