花生瘡痂病菌藍光受體EaWC 1基因克隆及生物信息學分析

李洋 張曉天 樸靜子 周如軍 李自博 關海雯

（沈陽農業大學植物保護學院，沈陽 110866）

光是細胞生物感知信號和適應環境重要的信息載體，在生長發育、有性生殖、次生代謝和晝夜節律等方面發揮著重要調控作用［1-2］。植物病原真菌的各種生理活動也同樣受到光調控，眾多研究結果表明，光對于真菌的形態建成、次生代謝和致病性等具有顯著影響［3-4］，但在不同種類真菌中的影響效應明顯不同。光照影響布萊克須霉（Phycomyces blakesleeanus）的生長發育和形態建成，孢子囊柄彎曲方向具有明顯的光趨向性［5-6］，而對于灰霉菌（Botrytis cinerea），光照負調控菌核產生和致病力［7］，光刺激竹黃菌（Shiraia bambusicola）分生孢子產量明顯增加，但次生代謝產物竹紅菌素（hypocrellin）產量卻顯著降低［8］，這些研究證實真菌光效應種間差異顯著。

真菌具有復雜且保守的光感系統-光受體（photoreceptor），主要包括藍光受體、紅光/遠紅光受體和綠光受體3種類型［9］，由于藍光受體更易受光刺激產生光信號，快速啟動光感系統，調控下游次生代謝產物編碼基因表達而備受關注［10-11］。Crosthwaite等［12］最早從粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）中克隆得到第一個真菌藍光受體基因WC 1，研究證實該受體對真菌晝夜節律、菌絲趨向性、無性發育、有性生殖和類胡蘿卜素等次生代謝產物生物合成具有調控作用［13］。目前在構巢曲霉（Aspergillus nidulans）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）、卷枝毛霉菌（Mucor circinelloides）、深 綠 木 霉（Trichoderma atroviride）、交鏈格孢（Alternaria alternata）、灰霉菌（B. cinerea）和玉米灰斑病菌（Cercospora zeae maydis）等多種真菌中均篩選鑒定到藍光受體WC 1同源基因［14-21］，光照培養C. zeae maydis野生型菌株和突變體發現，藍光受體基因CRP1存在能夠抑制孢子產生，促進毒力因子尾孢菌素（Cercosporin）積累，CRP1基因缺失明顯降低病菌致病性和病斑擴展能力［20］。

花生瘡痂病（Elsino? arachidis）是我國花生生產中的重要病害，發生普遍，危害嚴重。其致病菌能夠產生一種光敏性苝醌類真菌毒素——痂囊腔菌素（elsinochromes，ESC），ESC是痂囊腔菌屬重要的毒力因子，生物合成受到光調控［22］。目前，關于光調控ESC生物合成的研究報道相對較少，僅在柑橘瘡痂病菌（E. fawcettii）和花生瘡痂病菌（E. arachidis）中闡明了光照對ESC的生物合成具有正向調控作用［23-24］，而光質對ESC生物合成影響效應及調控機制的相關研究尚未見報道。研究團隊前期研究發現，藍光能夠顯著促進花生瘡痂病菌中ESC生物合成［24］，基因組中存在藍光受體WC 1同源基 因，命名為EaWC 1。在此基礎上，本文開展了花生瘡痂病菌藍光受體EaWC 1基因克隆，生物信息學分析和表達模式研究，旨在為藍光受體WC 1基因功能、ESC毒素生物合成受光調控機制和調控網絡研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

花 生 瘡 痂 病（Elsino? arachidis）菌 株LNJH-C01，分離自遼寧錦州花生種植基地。

1.2 方法

1.2.1 花生瘡痂病菌DNA提取 菌株采用涂布培養法［24］，25℃光照條件下培養14 d，設置光強度為30 μE·m-2·s-1，采用DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，NanoDrop ND-2000分光光度計檢測DNA質量，-20℃保存備用。

1.2.2 基因克隆 根據前期基因組數據進行藍光受體基因序列引物設計［24］，通過Primer 5.0軟件設計引 物Eawc-1F：5'- CAGCCATGATGCAAGGAC-3'，Eawc-1R：5'-TTGAGTGGGCGAGGCGTGT-3'。25 μL擴增體系，包括Mix酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，引物各1 μL，DNA模板1 μL。擴增條件為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸3 min，40個循環；72℃延伸8 min，1%瓊脂糖凝膠電泳。由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 用DNAMAN生物軟件進行序列比對，利用ORF Finder、Softberry Web Site、ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam）、NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、InterProScan、https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin）、Swiss model（https：//www.swissmodel.expasy.org）等在線軟件分析開放閱讀框、外顯子、內含子、編碼蛋白理化性質、保守結構域和二三級結構等信息，使用DOG 2.0軟件繪制結構域。

1.2.4 系統發育分析 通過使用NCBI數據庫，查找藍光受體WC 1同源基因的氨基酸序列進行BLAST分析，利用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹，基因序列信息見表1。

表1 WC 1同源基因序列信息Table 1 Sequence information of WC 1 homologous gene

1.2.5 花生瘡痂病菌EaWC 1基因的表達分析 病菌PDA培養基中黑暗培養14 d后，置于不同光質的LED燈下（白光波長450-465 nm，藍光波長490-530 nm），光強度為30 μE·m-2·s-1，以黑暗為對照，培養36 h，刮取菌絲，采用RNA提取試劑盒（普洛麥格生物技術有限公司）提取總RNA，置于-80℃保存。使用 HiFiScript cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）反轉錄cDNA。以Actin基因為內參基因，利用Primer Premier 5.0 軟件設計qPCR引物：EaWC-1-qF：5'-TATCGCCATCGGCACTCA-3'，EaWC-1-qR：5'-CGGATTCGGAAGACTACA-3'。反 應 程 序：94℃ 2 min；94℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 10 s，循環45次。每處理3次重復，以黑暗培養條件為對照，計算EaWC 1基因的相對表達量。

2 結果

2.1 EaWC 1基因克隆

從花生瘡痂病菌中克隆EaWC 1基因（GenBank MZ274346），全長為3 261 bp（圖1）。含有一條長度3 261 bp的完整開放閱讀框，編碼1 086 aa的蛋白，僅含有1個外顯子，無內含子。

圖1 EaWC 1基因PCR擴增Fig. 1 PCR amplification of EaWC 1 gene

2.2 蛋白結構預測

真菌藍光受體WC-1具有保守結構域，包括一個LOV（light oxygen voltage）域、兩個PAS（Per- Art-Ser）域和一個ZNF（zinc finger）結構域。結構域預測表明，花生瘡痂病菌EaWC-1蛋白同樣含有LOV（128 aa）、PAS（109 aa和114 aa）和ZNF（52 aa）結構域（圖2），花生瘡痂病菌結構域分布與N. crassa和C. zeae maydis等真菌中藍光受體編碼蛋白結構域基本吻合，僅在序列長度上存在細微差異。

圖2 WC-1 蛋白質結構域分析Fig.2 Protein domain analysis of WC-1

2.3 EaWC 1基因同源性分析

藍光受體WC 1基因的LOV結構域可結合黃素色團感知藍光。利用DNAMAN對真菌中藍光受體WC 1同源基因LOV結構域的氨基酸序列進行比對，結果表明，花生瘡痂病菌藍光受體EaWC1的LOV結構域與比對蛋白序列同源性80.1%，擁有11個結合黃素色團所需殘基（“↓”表示），以及參與光誘導反應的保守半胱氨酸殘基（“*”表示）（圖3）。

圖3 WC-1蛋白氨基酸序列比對Fig. 3 Amino acid sequence alignment of WC-1 protein

BLAST分析結果表明，EaWC-1編碼蛋白與粗糙脈孢菌（N. crassa）、葡萄黑痘病菌（E. ampelina）、 柑橘瘡痂病菌（E. fawcettii）和玉米灰斑病菌（C. zeae maydis）等多種真菌的特征基因和預測基因具有較高的同源性（圖4）。與葡萄黑痘病菌WC-1同源蛋白相似性最高達97.93%，其次為柑橘瘡痂病菌（94.06%），EaWC-1分布在痂囊腔菌屬形成的緊密分支中，表明所分析的序列為同源蛋白。

圖 4 EaWC-1蛋白序列系統進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of EaWC-1 protein sequence

2.4 EaWC 1基因生物信息學分析

2.4.1 理化性質及親疏水性分析 通過ExPASy網站ProtParam對EaWC 1基因所編碼蛋白的理化性質進行分析，分子量為119 563.30 Daltons，理論等電點（pI）為8.81，為堿性氨基酸。該蛋白脂溶性系數為57.92，不穩定系指數為49.71，為不穩定蛋白質；平均親水性指數為（GRAVY）為-0.739。利用Protscale 對EaWC 1編碼蛋白的疏水性/親水性預測分析，表明EaWC 1編碼蛋白在413位的I有最大值為2.133，疏水性最強，在948位的E有最小值為-3.711，親水性最強，多肽鏈表現出親水性（圖5）。

圖5 蛋白疏水性 Fig. 5 Protein hydrophobicity

2.4.2 編碼蛋白磷酸位點及亞細胞定位 對EaWC 1基因編碼蛋白是否存在可被激酶磷酸化的氨基酸殘基進行分析，結果顯示，該基因含有多個可被磷酸化氨基酸殘基，說明該蛋白可以被激酶磷酸化后發揮作用（圖6）。利用亞細胞定位在線分析工具分析，預測EaWC 1基因編碼蛋白可能定位在細胞核。

圖6 編碼蛋白磷酸位點分析Fig.6 Analysis of phosphate sites of encoded protein

2.4.3 蛋白信號肽及跨膜結構預測 使用在線工具分析EaWC-1蛋白是否存在信號肽及信號肽的剪切位點。分析顯示，編碼蛋白Sec信號肽（Sec/SPI）結構約為0.0005，不存在信號肽的剪切位點（CS），說明蛋白可能是非分泌蛋白。此外，跨膜結構預測表明，EaWC 1基因編碼蛋白不存在跨膜螺旋結構域，為非膜蛋白。

2.4.4 蛋白質二三級結構 EaWC 1基因進行了二三級結構預測，其中α螺旋有283個，占比26.06%；β轉角共有116個，占比10.68%；無規則卷曲共有509個，占比46.87%（圖7）。

圖7 蛋白二三級結構預測Fig. 7 Secondary and tertiary structure prediction of protein

2.5 基因表達量分析

光質對E. arachidis的ESC生物合成具有顯著影響，白光條件下毒素含量為54 nmol/plug，藍光處理促進ESC積累，毒素含量為71 nmol/plug，黑暗條件下未檢測到毒素產生。qPCR分析表明，白光和藍光條件下EaWC 1基因均顯著上調表達，相對表達量分別為黑暗培養的7.48倍和14.62倍（圖8-9），EaWC 1基因的表達模式與ESC毒素含量趨勢相同，該基因參與調控ESC生物合成。

圖8 病菌培養特性 Fig. 8 Culture characteristics of E. arachidis

圖9 EaWC 1基因表達分析及ESC含量Fig.9 EaWC 1 expression analysis and ESC production light quality

3 討論

細胞生物中光感應與傳導是一個復雜的生物過程，藍光受體是各種真菌生長發育和次生代謝等生理生化過程所必須的生物感受器。藍光受體WC 1編碼蛋白通常具有3個PAS結構域和一個鋅指結構域，其中兩個PAS域用于蛋白質-蛋白質互作，鋅指結構域用于核定位［25-27］，靠近N端的PAS域屬于一類特殊的結構域，稱為LOV結構域，也稱光、氧或電壓域。LOV結構域含有一個半胱氨酸殘基，光照條件下半胱氨酸與黃素色團（FAD）結合，發生電子轉移，形成半胱氨酰復合物，黑暗條件下，此過程發生逆轉，完成光周期循環［27-28］。雖然真菌藍光受體WC 1基因的結構域高度保守，但基因功能研究證明，該基因在種間的生物功能有所差異，模式真菌粗糙脈孢菌中WC 1基因影響生物鐘和類胡蘿卜素的生物合成［26］，而藍光受體Fgwc 1基因影響禾谷鐮孢菌有性繁殖和無性發育［16］。本研究在花生瘡痂病菌中克隆獲得藍光受體EaWC 1基因，對其進行生物信息學和同源聚類分析發現，該基因全長序列為3 261 bp，具有一個完整的開放閱讀框，編碼長度為1 086個氨基酸的蛋白質。具有明顯的藍光受體編碼基因WC 1的保守結構域，即一個LOV結構域，兩個PAS域和一個ZNF結構域。系統發育分析發現，EaWC 1與粗糙脈孢菌（N. crassa）、柑橘瘡痂病菌（E. fawcettii）和玉米灰斑病菌（C. zeae maydis）等真菌的藍光受體基因有高同源性，研究結果為花生瘡痂病菌藍光受體基因EaWC 1的功能及毒素光調控模式研究奠定了分子基礎。

基因表達是將遺傳信息通過轉錄、剪接和翻譯等方式轉變成功能產物的所有加工過程，能夠體現內部生理生化反映的調控及應答效應，是生物生命活動的基礎和關鍵［29］。光生物學研究表明，藍光受體WC 1基因的表達調控與多種真菌次生代謝產物的生物合成具有高度關聯性。光照能夠促進水稻惡苗病菌（F. fujikuroi）中鐮孢菌素（Fusarins）的生物合成，此時藍光受體WcoA基因高表達［30］，藍光受體LreA基因正向調控鏈格孢菌中Altertoxin（ATX）生物合成，但反向調節Alternariol（AOH）毒素產生［19］。花生瘡痂病菌ESC生物合成與光照密切相關，但光調控機制尚不清晰，本文開展了毒素含量與EaWC 1基因表達量相關性研究，結果表明，白光和藍光條件下EaWC 1基因均上調表達，藍光培養條件下基因表達量是白光下的2.15倍，其表達模式與ESC毒素含量趨勢相同，進而證明了花生瘡痂病菌ESC生物合成受到EaWC 1基因調控。目前除粗糙脈孢菌、構巢曲霉和鏈格孢菌等真菌藍光受體研究相對深入外，痂囊腔菌屬的光響應研究主要集中在生物學表型及表達量研究方面，而基因功能研究相對較少，調控模式和分子機制尚不清晰，應盡快開展藍光受體EaWC 1基因功能及ESC毒素生物合成光調控機制研究工作，為該病菌的致病機制、病原寄主互作和精準防控提供科學支撐。

4 結論

本研究成功克隆獲得了花生瘡痂病菌藍光受體編碼基因EaWC 1，全長為3 261 bp，編碼蛋白含1 086氨基酸，為不含信號肽和跨膜螺旋結構的堿性親水蛋白，主要定位于細胞核上。

光照條件顯著促進藍光受體基因EaWC 1上調表達，藍光條件下基因表達量最高，表達模式與ESC毒素含量趨勢相同，光受體基因EaWC 1在花生瘡痂病菌ESC毒素生物合成光調控過程中發揮著重要作用。