堆肥腐殖化：非生物學與生物學調控機制概述

解新宇 史明子 齊海石 吳迪 張旭 張椿浩 吳占海 魏自民

（東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

堆肥化是易腐有機固廢資源化、無害化處理的最廣泛的方式，具有污染小、成本低及效率高的優點。堆肥化處理的終極目標是固定碳，并完成有機組分向腐殖質的轉化，該過程又稱為腐殖化進程。腐殖質作為腐殖化進程的主要副產物被眾多研究者廣泛研究［1-2］。腐殖酸是一類組成成分復雜的混合物質，其結構中包含碳水化合物、蛋白及脂類等，有的會與芳香族化合物相結合，一般包括一些被部分分解的木質素單體、單寧、多酚、醌及其他微生物次級代謝的聚酮類物質等［3］。腐殖質由于其具有較強的離子交換及絡合能力，常常被用作環境修復劑去緩解有機、無機以及重金屬污染［4］。

近年來，國內外對于腐殖質形成機制的研究起始于土壤，而堆肥可看作是土壤的快速腐殖化進程。有研究表明，堆肥物料的腐殖酸結構與土壤中腐殖酸相比較為“稚嫩”［5］。眾多研究學者發現堆肥腐殖酸中含有甲氧基、醇羥基、羰基、羧基、酚羥基、醌基等眾多含氧基團，并總結出許多腐殖酸結構模型，其中最具有代表性的是Stevenson的腐殖酸結構模型［6］。

通常，堆肥是有機物動態變化的過程，根據有機組分變化情況，一般將堆肥進程劃分成兩個階段，即活化階段和固化階段。活化階段是在微生物的參與下易被分解利用物質被微生物所消耗的過程，以滿足微生物生長所需營養物來源。因此，堆肥過程微生物活動主要存在分解（即微生物分解有機物以維持基本代謝活動，此過程主要以有機物消耗礦化產生CO2為主）與合成（即參與到分解產物再轉化過程，此過程主要以縮合形成腐殖酸為主）兩種代謝途徑［7］。兩種途徑共同作用，在堆肥進程中相輔相成，促進腐殖化進程的順利進行。

1 腐殖化進程的非生物學途徑調控機制

腐殖酸合成主要由化學反應所驅動，即多種腐殖酸前體彼此之間通過縮合或聚合的方式形成腐殖酸大分子。據報道，腐殖酸形成的非生物途徑主要可歸為四大類，即木質素-蛋白理論、多酚自縮合、多酚-蛋白途徑以及美拉德反應［6］。木質素單位與氨基酸發生反應，形成腐殖質分子的核心，因此被稱為木質素-蛋白質理論。然而隨著對腐殖酸結構的進一步認知，發現腐殖酸核心骨架一般由一種芳香的含氮物質構成。這種含氮物質通常以蛋白質或氨基酸的形式存在，隨后提出了類似于木質素-蛋白質理論的酚-蛋白質理論，以替代木質素-蛋白理論。多酚自縮合則是多酚化合物通過環斷裂后再與其他酚類化合物進行縮合，從而形成腐殖酸大分子結構。美拉德反應是指還原糖與氨基酸以及蛋白質之間的多重復雜反應，又被稱為非酶棕色化反應。還原糖的美拉德反應被認為是堆肥初期腐殖酸形成的主要原因［8］。在堆肥過程中，物料本身性質是非生物途徑的決定因素，這是由于堆肥物料分解或水解可為非生物途徑形成提供底物，但由于物料自身性質的復雜性，往往多種非生物途徑共同作用于腐殖酸形成。

在堆肥進程中，微生物會與非生物途徑競爭底物，導致非生物途徑進展緩慢，致使大量的腐殖酸前體被微生物所消耗以滿足其生長活動所需的營養消耗。因此，為加速堆肥中非生物途徑進程，多種功能材料被添加以提升腐殖酸形成，加速非生物途徑，從而減少腐殖酸前體物的浪費，減少碳排放，固定更多的碳元素。在眾多功能材料中，二氧化錳由于其優良的催化性能、較強的離子交換能力以及氧化還原性，被廣泛選擇作為腐殖酸形成的非生物途徑的催化劑［9］。二氧化錳可催化氨基酸與還原糖聚合成腐殖酸骨架，加速腐殖化進程［1］。與此同時，二氧化錳還可催化酚類化合物的環斷裂，這有助于酚類化合物與其他前體物之間聚合或縮合反應的發生。非生物途徑由于其在腐殖酸形成中的重要性越來越受到關注。

2 腐殖化進程的生物學途徑調控機制

2.1 CO2的生物固定與腐殖化

目前，堆肥方面的研究很少將CO2的釋放與堆肥腐殖酸的形成聯系在一起，表面上看二者無明顯關聯，因為CO2主要產生于堆肥中、前期，而腐殖酸則主要形成于堆肥腐熟后期［10］。但是，綜合腐殖酸形成的幾種學說（木質素-氨基酸復合體為核心的木質素學說、酚氧化為醌后與含氮化合物縮合的多酚學說、微生物合成學說、以植物及微生物殘體為核心的糖-胺縮合假說）可以發現，腐殖酸的核心部分為芳香族類物質，與其結合的氨基酸、糖類、含氮化合物等大都來源于碳代謝的中間產物［11］，由于這些代謝中間產物結構簡單，大都在堆肥前期在微生物作用下快速分解，是堆肥CO2釋放的主要來源［12］。因此，如果對有機物質代謝途徑加以調控，抑制各類有機物代謝的三羧酸循環，在減少堆肥CO2釋放的同時，又為堆肥腐熟后期腐殖酸的形成提供了原材料，達到有機廢棄物堆肥資源化效率最大化［13］。

堆肥體系中腐殖酸的形成以及碳動態變化最終是微生物生長和活動的結果，土壤“微生物碳泵”（microbial carbon pump）可以解釋微生物是如何介導堆肥過程進行碳轉化的，說明微生物是如何在堆肥體系中發揮積極作用的。當堆體中易分解的小分子物質較多，穩定有機組分含量較少時，微生物代謝比較活躍，這時容易發生礦化，因為更多的能源用于進行細胞呼吸同時生成CO2，這不利于體系內的碳儲存，導致腐殖酸生成量較少，此時啟動效應（start-up effect）強于掩埋效應（entombing effect）。當堆肥體系中可以被微生物直接利用的有機組分逐漸減少，由微生物從胞內釋放的水解酶開始水解胞外大分子復雜有機組分，從而為細胞生長提供所需能源，同時開始合成腐殖酸形成所需的前體物［14-15］，此時掩埋效應與啟動效應達成平衡狀態。如果只是簡單降低所有微生物的代謝強度，其腐殖酸的合成也會受到抑制。因此，合理調控某些微生物代謝強度，使其向分解有機組分從而合成腐殖酸為主要方向發展，將對促進有機固廢高質資源化有重要意義。

2.2 木質纖維素分解與腐殖化

木質纖維素組分是農業廢棄物中較豐富的組分，主要由纖維素、半纖維素和木質素等三維網狀結構組成［16］。纖維素是由葡萄糖單元通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的線性大分子化合物，半纖維素是由己糖、戊糖和葡萄糖醛酸組成的雜多糖化合物［17］。由于半纖維素結構松散，結構非結晶化、高度分支，它的分解較纖維素容易。木質素是由苯丙烷亞基通過醚鍵或者碳碳鍵連接的高分子化合物，由于其結構高度復雜，酶水解極其困難。據報道，木質素存在于纖維素和半纖維素表面，阻礙了纖維素和半纖維素酶的與外界的接觸，降低了纖維素和半纖維素的生物轉化［18］。因此，木質素結構的打散對于整個木質纖維素的利用及轉化極為重要。

在堆肥過程中，木質纖維素的分解需要纖維素酶、半纖維素酶及木質素酶的參與。其中，纖維素的水解需要3種酶的參與，包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖甘酶［19］。它們共同作用在纖維素表面，釋放纖維糊精、纖維二糖及葡萄糖，其中β-葡萄糖甘酶水解纖維二糖的糖苷鍵，產生大量的葡萄糖。同樣，半纖維素酶根據主鏈及側鏈的結構分為主鏈分解酶和側鏈分解，生成的小分子阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖等單糖都能進入細胞內進行糖酵解和三羧酸循環，徹底礦化形成CO2和H2O［10］。因此，在堆肥過程中，有效控制小分子單糖的產生，促使纖維二糖、木二糖向腐殖酸轉化。此外，木質素過氧化物酶、漆酶、錳過氧化物酶及纖維二糖脫氫酶是目前研究較熱的木質素酶，主要對木質素側鏈殘基進行氧化并分解，形成單苯環或者多苯環化合物。同樣，上述中間代謝產物也可作為腐殖酸前體與其它前體聚合向腐殖酸轉化。堆肥進程中細菌主要在初級代謝過程中合成木質素酶，而真菌主要在次生代謝過程中產生木質素酶分解木質素［20］。因此，根據微生物生長特征進行合理的控制微生物的活性，增加微生物產酶量，并對木質纖維素進行分解如圖1所示［21］。此外，影響木質纖維素酶的合成因素有很多［20］，例如碳源、氮源、微量元素、金屬離子、酶促誘導物及表面活性劑，這些都是考慮的關鍵因素，找到酶促活性的關鍵影響因素對于木質纖維素酶的產生有重要的作用，能夠快速分解木質纖維素組分，這對于腐殖酸的形成提供了支撐。

圖1 堆肥過程機理圖Fig. 1 Diagram of the mechanism of the composting

在堆肥過程中，木質纖維素組分分解并產生碳水化合物、氨基酸、苯環化合物，它們不僅作為腐殖酸形成的骨架，而且可以縮合形成腐殖酸。美拉德反應學說主要強調堆肥中木質纖維素分解的多糖與氨基酸進行縮合。當堆肥進行到高溫期末時，木質纖維素分解多糖較多，可添加富含氨基酸、蛋白質等含量高的有機廢棄物進行縮合，促進腐殖酸合成。微生物形成假說主要強調了微生物在腐殖酸形成過程中的作用。微生物在堆肥過程中扮演著多方位的角色，不僅作為分解者分解大分子聚合物，而且作為生產者將分解的小分子化合物重新縮合形成腐殖酸類物質［22］。因此，木質纖維素分解產物均是腐殖酸形成的骨架及底物。在合適的時期，添加富含蛋白的有機廢棄物，增加木質纖維素酶的活性通過控制關鍵因素對于木質纖維素廢棄物向腐殖酸轉化提供一個必要的選擇。

2.3 反硝化過程與腐殖化

在微生物的參與下，反硝化作用利用硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、氧化氮還原酶以及氧化亞氮還原酶，將硝酸鹽、亞硝酸鹽逐級還原，最終形成一氧化氮、氧化亞氮或氮氣并釋放出來［23］。由于反硝化作用是造成氮損失的重要原因，同時釋放臭氧層破壞者——溫室氣體，因此在環境及農業領域一直作為研究焦點［24］。在好氧堆肥過程中，反硝化作用受到的關注相對較少，其重要性往往容易被忽視，主要由于其被認為是在嚴格的厭氧條件下才能存在。近年來，已經證實反硝化作用存在于好氧堆肥中，尤其是在含氮素豐富，含水率高的有機固體廢棄物中［25-26］。在堆肥過程中，由于堆肥原料被壓實和堆積，或堆肥顆粒半徑較長，形成堆肥團聚體，阻礙氧氣的進入，使堆肥內部空氣滲透性和流動性下降，導致局部厭氧，從而發生反硝化作用［27］。另外，固有觀念認為反硝化微生物大多為厭氧菌，只有在嚴格的厭氧條件下才能啟動反硝化作用［28］。實際上，反硝化作用在好氧條件下也可以發生，許多反硝化微生物已被證實能夠進行好氧呼吸［29-30］。

在堆肥過程中，考慮到具有芳香分解能力的反硝化微生物可能會對堆肥芳香族類化合物腐殖酸的形成產生潛在的危害［26，31］。基于此，有研究發現，若堆肥中反硝化作用的電子受體硝酸鹽含量過高同樣可有效地促進反硝化作用，并導致芳香族類化合物腐殖酸含量下降。當硝酸鹽含量較高時，參與芳香族類化合物腐殖酸前體（鄰苯二酚、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）分解途徑相關物種顯著富集。例如，Paracoccus為典型的反硝化微生物，同時是編碼芳香氨基酸轉氨酶的物種來源，并參與了酪氨酸的分解，其在硝酸鹽含量高的情況下，Paracoccus豐度顯著升高。反硝化微生物Pseudomonas代謝功能更具多樣性，可以是編碼兒茶酚1，2-雙加氧酶、芳香族氨基酸轉氨酶、色氨酸2，3-雙加氧酶、苯乙酰輔酶A連接酶的物種來源［32-33］。此外，已證實微生境可以驅動具有芳香生物分解功能的反硝化微生物與腐殖酸的相互作用。添加硝酸鹽可以顯著影響微生境包括細菌群落多樣性及有機質、氨含量等環境因子。微生境的改變進一步驅動了具有芳香生物分解能力的反硝化微生物。而多數芳香生物分解能力的反硝化功能微生物間呈現合作關系。總體而言，反硝化作用在堆肥中可以刺激具有芳香化合物分解能力的功能微生物代謝活性，導致芳香族化合物前體的裂解，最終影響的芳香族化合物腐殖酸的合成與積累。值得一提的是，研究發現由于不同堆肥原料特性差異較大，不同物料堆肥過程中均具有反硝化微生物，但豐度及多樣性各不相同［26］。反硝化微生物在園林垃圾中總體豐度在堆肥過程中呈下降趨勢，但在雞糞和秸稈垃圾中，反硝化微生物豐度總體豐度呈上升趨勢。且各物料主導的反硝化微生物具有差異性，如雞糞堆肥中主導反硝化作用的微生物為Pseudomonas、Sphingomonas及Pusillimonas。而Acinetobacter、Sphingomonas、Ochrobactrum在園林垃圾中豐度較高［14］。因此，反硝化作用與芳香族類化合物腐殖酸生物穩定性關系在各堆肥物料中需要更進一步研究及驗證。

2.4 堆肥前體物與腐殖化

前體物對腐殖酸的相對分子質量和結構復雜程度將有一定的影響。通過相關性分析發現酚類、羧基、氨基酸、還原糖與腐殖酸呈現明顯負相關關系［34］，所以研究者認為它們是合成腐殖酸的重要前體物。酚類主要來源與木質素類物質，或者由微生物胞內合成，同時酚類將在多酚氧化酶作用下生成醌基化合物，但在有氧條件下，酚羥基不穩定，作為腐殖酸的芳香族骨架通過多酚-蛋白途徑聚合促進其形成［30］。氨基酸和還原糖也是細菌代謝所需的能量和碳源，氨基酸和還原糖的生成量越大，對促進腐殖酸合成的作用越明顯［35］。因此，如果微生物利用了較多的氨基酸和還原糖，將會造成腐殖酸生成量的減少，降低堆肥品質。此外，有研究發現，在多酚缺失或者不足的環境條件下，還原糖與氨基酸同樣能夠參與合成腐殖酸，這證明了氨基酸、還原糖對合成腐殖酸起到重要作用。因此，適度調控腐殖酸前體物也可以達到控制腐殖化進程的目的。

3 總結和展望

堆肥作為農業有機固體廢棄物處理的可持續技術手段，科研工作者一直致力于不斷提升堆肥腐殖化程度，增加腐殖質產量，且此項工作已經取得了較大突破。從非生物學及生物學途徑出發，針對堆肥不同生境，掌握堆肥腐殖化調控策略，為今后的研究奠定了理論與方法學基礎。非生物學合成腐殖質的研究中，從4種腐殖質合成途徑出發，針對木質素-蛋白理論、多酚自縮合、多酚-蛋白途徑以及美拉德反應合成框架，結合現代化學合成過程，已經演變出人工腐殖質合成技術。研究者利用焦磷酸鈉堿液及氫氧化鈉溶液從褐煤中提取腐殖質，是現今較完善的化學合成腐殖質的方法，但褐煤屬于不可再生資源，大量的消耗也會給地球環境生態帶來較大壓力［36-37］。因此，研究者進一步開發出利用酸堿水熱技術促進廢棄物腐殖質的轉化技術，先后從秸稈、污泥等廢棄物中提取腐殖質，該技術提取出的人造腐殖質中含有較多的芳烴及長鏈脂肪烴結構，且利用該法提取的腐殖質在結構和形態上與土壤中天然合成的腐殖質具有較高的相似性［38］。由此，水熱提取腐殖質以其成本低、易規模化等優勢，具有廣泛的應用前景，相信未來有望實現廣泛推廣。在生物學腐殖質合成層面，隨著組學、分子標記、微流控等技術的發展，結合新興統計學及生物信息學手段，首先明確促腐殖質合成功能微生物組與組外微生物群落之間及功能微生物組內相關微生物之間的相互關系，捕獲必要的腐殖質生成途徑生態學原理及關鍵限制因子（微生境與微生物之間或微生物與微生物之間），以分子生態學模型精確預測微生物組腐殖質生成量。其次，以上述過程為基礎，通過外加促腐材料及生態群落改造的形式優化微生物群落生態位，增加腐殖質相關途徑合成通量，從根本上增加腐殖質合成總量。另外，也可通過大數據分析推進不可培養功能微生物組的分選與價值提升，從微流控細胞分選技術出發，在復雜樣品中自動分選穩定同位素標記的細胞，進而結合組學技術進行實驗室培養，開發完成一整套腐殖質合成不可培養功能微生物組組學原位工具，以此將腐殖質高效合成功能引入合成腐殖質的原生環境，達到腐殖質在堆肥過程中的高產。綜上所述，隨著科學技術水平的不斷提高，相信未來堆肥腐殖化將會更加現代化、智能化，促進非生物及生物學途徑腐殖化進程的高質資源化進行。