頂空-氣相色譜法測定硫酸羥氯喹中環氧乙烷殘留量的方法學研究

焦陽

上海上藥中西制藥有限公司（上海 201806）

硫酸羥氯喹，即（±）-2-[[4-[（7-氯-4-喹啉基）氨基]苯基]-乙氨基]乙醇硫酸鹽，其化學式為C18H26ClN3O·H2SO4，化學結構如圖1所示。

圖1 硫酸羥氯喹的化學結構

類風濕性關節炎（RA）是一種常見的免疫和炎癥性疾病，臨床病癥主要為骨節組織受損，常呈現肢體腫脹、骨節作痛且硬實強直等情況[1]。糖尿病是一種代謝性疾病，主要臨床特征表現為慢性血糖增高。糖尿病病人的胰島β細胞只能分泌正常人體胰島素含量的一半左右，嚴重妨礙了人體控制血糖能力[2]，影響身體健康。

硫酸羥氯喹是醫治類風濕性關節炎合并糖尿病病人的常用抗瘧藥，且安全性高。該藥物除可以緩解病人的關節炎病癥，還能阻礙血小板的聚集，起到降血糖、抗血脂的作用。20世紀50年代，隨著抗瘧藥應用于類風濕關節炎和系統性紅斑狼瘡（SLE）的診治，部分病人在接受抗瘧藥物醫治后出現了低血糖征象，硫酸羥氯喹醫治風濕性疾病療效顯著[3-4]。硫酸羥氯喹因為具有獨特的作用機制，且安全性較好，所以在臨床風濕病領域被普遍應用，至20世紀90年代，硫酸羥氯喹用于醫治90%以上的臨床風濕病[5]。

環氧乙烷是硫酸羥氯喹潛在基因毒性雜質，過量吸入會引起急性中毒，損害呼吸系統、中樞神經系統；如果周圍環境含大量環氧乙烷，會對眼睛和上呼吸道產生刺激，并伴有嚴重的頭痛、惡心和嘔吐，嚴重者呼吸困難，昏迷，甚至死亡。環氧乙烷還是人體致癌致畸物質，若孕婦接觸，流產率會增高[6-7]。因此，為保證患者安全用藥，需對藥品中環氧乙烷的量進行控制。

依據人用藥物注冊技術要求國際協調會ICH M7（R1）《評估和控制藥物中DNA反應性（致突變性）雜質以限制潛在致癌風險》指南，環氧乙烷的可接受攝入量按21.3μg/d進行控制，結合硫酸羥氯喹原料每日最大攝入量（400 mg），所含環氧乙烷的限度為0.005 325%，即嚴格控制硫酸羥氯喹中環氧乙烷質量分數不得超過0.005 325%。采用頂空-氣相色譜法對硫酸羥氯喹潛在基因毒性雜質環氧乙烷的殘留量進行研究，參考ICH Q2（R′）《分析方法驗證：正文和方法學》雜質定量檢測方法學驗證要求，系統進行了驗證。

1 實驗部分

1.1 儀器

MS105電子分析天平，梅特勒-托利多國際貿易有限公司；Agilent 7890B氣相色譜儀、Agilent 7697A頂空進樣器，安捷倫科技有限公司；GC2014C氣相色譜儀、DANI HSS 86.50 Plus頂空進樣器，島津制作所。

1.2 試劑

環氧乙烷（批號KYEK402），北京伊諾凱科技有限公司；乙腈（批號R141827），北京迪科馬科技有限公司；乙腈（批號JB09130），默克股份兩合公司。環氧乙烷為分析純，乙腈為色譜純。

1.3 樣品

硫酸羥氯喹樣品（批號HS20181101V，HS20181102V，HS20181103V），上海中西三維藥業有限公司。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱為DB-624毛細管柱（30 m×0.32 mm×1.80μm）。升溫程序：起始溫度為35℃，保持3 min，以25℃/min的速率升溫至150℃，保持3 min。進樣口溫度為120℃，氫火焰離子化檢測器（FID）溫度為200℃，頂空平衡溫度為60℃，進樣環溫度為75℃，傳輸線溫度為100℃；頂空平衡時間為15 min；柱流量為2.0 mL/min；進樣量為1 mL，分流比為10∶1；載氣為氮氣；氫氣流速為30 mL/min，空氣流速為400 mL/min，氮氣流速為25 mL/min。

1.4.2 溶液的配制

（1）稀釋劑：乙腈。

（2）對照品溶液：取適量環氧乙烷（低溫下）精密稱定，用乙腈稀釋，配制成1 mL中約含環氧乙烷10.65μg的溶液。

（3）供試品溶液：精密稱定環氧乙烷200 mg，置于頂空瓶中，加乙腈1 mL，密封，搖勻。

1.4.3 測定方法精密量取稀釋劑乙腈、對照品及供試品溶液各1 mL，置于頂空瓶中，密封，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖；采用外標法，以峰面積計算各溶液中環氧乙烷的含量。

2 結果與討論

2.1 專屬性試驗

取適量環氧乙烷粉末（約200 mg），精密稱定，置于頂空瓶中，精密加入對照品溶液1 mL，密封，搖勻，作為加標溶液；分別取稀釋劑乙腈及對照品溶液、加標溶液、供試品溶液，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。環氧乙烷的拖尾因子為1.1，峰保留時間為2.384 min，理論塔板數為10 390.3。結果表明：稀釋劑乙腈與供試品溶液中的雜質峰對檢測均無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.2 檢測限、定量限測定

取環氧乙烷對照品適量（低溫條件下），精密稱定，加乙腈定量稀釋成一系列質量濃度的溶液，分別頂空進樣分析，記錄色譜圖。檢測限按信噪比3∶1計算，定量限按信噪比10∶1計算。定量限溶液平行配制6份，分別頂空進樣分析，計算峰面積和保留時間的相對標準偏差（RSD）。結果見表1～2。

表1 環氧乙烷檢測限、定量限測定結果

表2 環氧乙烷定量限試驗結果

環氧乙烷檢測限、定量限均遠低于限度。定量限質量濃度下6份樣品的峰面積RSD為3.4%，小于10.0%，保留時間的RSD為0.1%，小于2.0%，表明方法靈敏度良好。

2.3 線性和范圍試驗

取環氧乙烷對照品適量（低溫條件下），精密稱定，加乙腈稀釋成每1 mL中約含環氧乙烷106.5μg的溶液，得線性儲備液（10倍對照品質量濃度）。分別移取儲備液，1 mL置于20 mL容量瓶中、2 mL置于25 mL容量瓶中、1 mL置于10 mL容量瓶中、3 mL置于25 mL容量瓶中、3 mL置于20 mL容量瓶中、2 mL置于10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋、定容至刻度，作為線性供試液；另取定量限溶液作為線性供試液。

精密量取上述7個線性供試液各1 mL，分別置于頂空瓶中，進樣分析，以峰面積對質量濃度進行線性回歸。結果見圖2。

圖2 環氧乙烷標準曲線

環氧乙烷線性方程為y=4.365 0x-1.285 9（r=0.999 5）。環氧乙烷在定量限至2倍限度范圍內，質量濃度與峰面積線性關系良好；相關系數r=0.999 5，大于0.999；Y軸截距為2.84%，在100%響應值的10.0%以內；響應值（A/C）RSD為2.18%，小于10.0%。

2.4 精密度試驗

2.4.1 進樣精密度

精密量取同一對照品溶液6份，每份1 mL，置于6個頂空瓶中，密封，連續進樣，記錄色譜圖。

對照品溶液連續進樣6次，環氧乙烷峰面積RSD為3.5%，小于5.0%，表明進樣精密度良好。

2.4.2 重復性

精密稱定環氧乙烷約200 mg，置于頂空瓶中，加對照品溶液1 mL，密封，搖勻，作為重復性溶液，平行配制6份。

取對照品溶液、重復性溶液，分別頂空進樣，計算6份供試液中環氧乙烷殘留量的RSD，記錄色譜圖，結果見表3。

表3 重復性試驗結果%

6份重復性溶液中環氧乙烷殘留量的RSD為2.3%，小于5.0%，表明重復性良好。

2.4.3 中間精密度照2.4.2方式配制樣品，由不同的分析員在不同日期使用不同的儀器進行檢驗，結果見表4。

表4 中間精密度試驗結果

由表4計算可知，不同人員在不同日期配制的12份加標供試品溶液中環氧乙烷質量分數的RSD為3.3%，小于10.0%，表明精密度良好。

2.5 溶液穩定性試驗

精密稱定環氧乙烷約200 mg，置于頂空瓶中，加對照品溶液1 mL，密封，搖勻，作為穩定性溶液，平行配制5份。

取穩定性溶液，在室溫下放置，分別在0，2，4，6，8 h進樣分析，計算峰面積的RSD，考察溶液穩定性。結果表明，在8 h內，樣品中環氧乙烷峰面積的RSD小于5.0%，說明溶液穩定性良好。

2.6 準確度試驗

對照品貯備液配制：稱取環氧乙烷適量（低溫條件下），加乙腈稀釋成每1 mL中約含環氧乙烷106.5 μg的溶液，作為對照品貯備液（10倍對照質量濃度），平行配制3份。

50%對照品溶液、100%對照品溶液、150%對照品溶液的配制：分別取對照品貯備液2.5 mL置于50 mL容量瓶中、5 mL置于50 mL容量瓶中、3 mL置于20 mL容量瓶中，用乙腈定容，分別平行配制3份。

平行配制2份供試品溶液。

取100%對照品溶液，精密量取1 mL，置于頂空瓶中，密封，平行3份。

準確度溶液配制：取環氧乙烷約200 mg，精密稱定，置于頂空瓶中，配制9份（分3組），每組分別精密加入50%對照品溶液、100%對照品溶液、150%對照品溶液各1 mL，搖勻即得。

取稀釋劑乙腈、供試品溶液、100%對照品溶液和準確度溶液，分別頂空進樣，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖并計算其回收率，結果見表5。

表5 環氧乙烷準確度試驗結果

在50%～150%質量濃度水平下，環氧乙烷回收率在98.47%～105.75%之間，平均回收率為102.08%，RSD為2.7%。回收率均在90.0%～110.0%之間，RSD小于5.0%，表明方法準確度好。

2.7 耐用性試驗

加標供試品溶液配制同2.1。

分別取稀釋劑乙腈、對照品溶液、加標供試品溶液，在標準色譜條件、色譜柱流量變化±0.2 mL/min、起始溫度變化±2℃、頂空平衡時間變化±5 min時頂空進樣分析，計算環氧乙烷殘留量的RSD，考察耐用性，結果見表6。

由表6可知，在色譜柱流量變化±0.2 mL/min、柱溫起始溫度變化±2℃、頂空平衡時間變化±5 min時，乙腈、樣品溶液中的雜質峰對檢測均無干擾，環氧乙烷質量分數的RSD均小于10.0%，表明方法耐用性良好。

表6 耐用性試驗結果

2.8 樣品檢測

用確定的色譜條件進行樣品檢測，結果見表7。

表7 樣品測定結果

3批樣品中環氧乙烷均未檢出，說明樣品質量符合要求。

3 結語

采用DB-624毛細管柱（30 m×0.32 mm×1.80 μm），以氮氣為載氣、氫氣為燃料氣、空氣為輔助燃氣，持續升溫，建立了頂空-氣相色譜法對硫酸羥氯喹潛在基因毒性雜質環氧乙烷的檢驗分析方法。該方法專屬性高，稀釋劑（乙腈）及供試品中的雜質峰對檢測均無干擾，精密度好、耐用性優異，溶液質量濃度和峰面積之間的相關性顯著。總之，該方法操作簡便，檢測快速，結果穩定、準確，適用于硫酸羥氯喹潛在基因毒性雜質環氧乙烷的檢測。