t檢驗和HorRat方程在方法驗證中的應用

朱東波 吳雄杰項 楊 吳先鋒 高 江 姚 成

安徽省包裝印刷產品質量監督檢驗中心 國家高分子材料質量檢驗檢測中心（安徽）（安徽桐城 231400）

CNAS CL01-2018（ISO/IEC17025:2017）《檢測和校準實驗室能力認可準則》和RB/T 214—2017《檢驗檢測機構資質認定能力評價 檢驗檢測機構通用要求》中，明文規定了實驗室在引入方法前，應驗證能夠正確地應用該方法，以確保實現所需的方法性能，并應保存驗證記錄。如果方法標準發布機構修訂了方法，應在所需的程度上重新進行驗證[1-2]。可見，方法驗證在今后檢驗檢測實驗室的資質能力認可/評價中日益重要。GB/T 27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》定義了方法驗證，即實驗室通過試驗，提供客觀有效證據，證明滿足檢測方法規定的要求；對于定量分析的方法驗證過程中的關鍵參數，至少應測定正確度和精密度[3]。正確度是指測量結果的正確度用于表述無窮多次重復性測定結果的平均值與參考值之間的接近程度[3]。

在方法驗證過程中，常常通過測量參考物質或標準物質來獲取正確度的信息。此外，也可通過加標回收試驗，利用回收率驗證方法的正確度。回收率越低，偏倚對方法的影響越大，正確度就越低。但是，大多數檢測項目沒有參考或標準物質，這種情況下，實驗室只能依賴于統計學評價（t-檢驗和F-檢驗）對分析方法的偏倚顯著性進行評估。精密度是指在規定條件下，對同一或類似被測對象重復測量所得示值的一致程度[3]。精密度僅依賴于隨機誤差的分布，與真值或參考值無關。測定精密度取決于規定的測量條件，重復性和再現性條件是測量條件的兩個極端情況，因此精密度通常可分為重現性精密度和再現性精密度。精密度通常有3種方式表示：用標準偏差和變異系數進行評價；通過方法比對評價重復性/再現性或重復性限/再現性限；當方法標準中沒有給出精密度或沒有比對方法時，實驗室可以通過采用Horwitz方程和HorRat方程計算的結果來評價精密度。

本研究以SH/T 1591—1994《乙烯-乙酸乙烯酯共聚物（E-VAC）中乙酸乙烯酯含量測定方法》的方法驗證為例，對方法的正確度和精密度進行數據分析及評價，利用t檢驗和HorRat方程建立相應的方法驗證評價方法。

1 實驗方法

按照SH/T 1591—1994要求，根據乙酸乙烯酯含量稱取m（g）樣品置于250 mL錐形瓶中，加50 mL二甲苯和25 mL氫氧化鉀-乙醇，將錐形瓶轉入回流冷凝器上，加熱至200℃并保持2 h，取下冷卻至室溫，加入25 mL 6 g/L硫酸溶液，加入酚酞溶液，用濃度為c（mol/L）的氫氧化鈉溶液進行滴定，記錄滴定消耗體積V1（mL），同時做空白試驗，記錄滴定消耗體積V2（mL）。根據公式wVAC( )=其中0.086 09表示與1.0 mL氫氧化鈉標準溶液[c( N aOH)=1.000 mol/L]反應的乙酸乙烯酯的質量（g），計算乙酸乙烯酯的檢驗結果。

2 結果與分析

2.1 正確度

在無法獲取參考或標準物質時，采用比對試驗進行正確度分析；當每組檢測的平行次數為n（n≥6）時，可先對兩組數據進行F檢驗，分析是否有顯著性差異，若無顯著性差異，再按照t-檢驗對試驗結果進行分析，若結果小于t臨界值，可認為測定結果與標準值之間無顯著性差異[4]。

兩位試驗人員在同一環境中，使用相同的試劑、標準溶液以及同一滴定管，在規定的時間內，各自連續測定8次，結果如表1所示。

表1 兩組實驗結果%

依據GB/T 4883—2008《數據的統計處理和解釋正態樣本離群值的判斷和處理》要求，對兩組實驗結果是否有離群值或異常值進行判斷和處理，運用格拉布斯（Grubbs）檢驗法對檢驗結果進行顯著性偏差分析，取置信概率為95%，即α=0.05。

當Gn＞G1-α(n)時，判定xn為離群值，否則判未發現xn是離群值。格布拉斯公式：Gn=xn-ˉ( )s；其中和s分別為樣品均值和樣品標準偏差。查格布拉斯臨界值表可知G0.95(8)=2.032。

按升序順序對人員1的檢驗結果進行排序：6.03，6.15，6.19，6.23，6.32，6.45，6.57，6.61，樣本量平均值=6.32，樣品標準偏差s=0.21，則G(8)=1.381＜G0.95(8)=2.032。G(1)=1.381＜G0.95(8)=2.032。因此，未發現x(8)=6.03和x(1)=6.61是統計離群值，即該組檢測結果無離群值。

按升序順序對人員2的檢驗結果進行排序：6.21，6.30，6.34，6.53，6.61，6.66，6.68，6.84，樣本量平均值=6.52，s=0.22，G(8)=1.454＜G0.95(8)=2.032，G(1)=1.409＜G0.95(8)=2.032。因此未發現x(8)=6.84和x(1)=6.21是統計離群值，即該組檢測結果無離群值。

兩組檢測結果均無離群值，可進行下一步分析。

2.1.1 F檢驗

2.1.2 t檢驗

取置信區間p=0.95，α=0.05，查t分布表可知，tα,n1+n2-2=t0.05,14=2.14。t=1.88＜t0.05,14，可認為測量結果與標準值之間無顯著性差異，比對試驗結果滿意。

由上述統計學評價結果可知，其正確性滿足標準要求。

2.2 精密度

精密度包括重復性和再現性。根據食品法典委員會《微量元素標準化的轉化方法》和歐盟Commission Regulation（EC）No337/2007報告，采用Horwitz方程和HorRat方程來判斷精密度是否接受[5-6]。重復性值和再現性值分別為HorRatr和HorRatR，要求HorRat值小于2。再現性相對標準偏差期望值為RSDoR，重復性相對標準偏差期望值為0.66RSDoR。

式中：w為質量分數，RSDoR為期望相對標準偏差，RSDR為實際相對標準偏差；

2.2.1 不同人員進行VAC含量的再現性實驗，進行精密度分析

兩組檢驗結果的平均值：

2.2.2 對人員1測量結果進行重復性精密度分析

由HorRat的結果可知，其精密度滿足要求。

3 結語

兩組實驗人員采用同一檢測方法，使用同一試劑及儀器進行檢測，兩組結果與標準值無顯著差異，即正確度符合要求；精密度的重復性和再現性實際標準偏差均小于標準偏差期望值，精密度符合要求。可知，大多數沒有參考或標準物質的檢測項目，通過t檢驗和HorRat方程進行分析方法驗證確實可行，也為實驗室依照CNAS CL01-2018制定方法確認和驗證程序文件及作業指導書提供了參考。