貫葉連翹-舍曲林聯(lián)用對(duì)抑郁模型大鼠的藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)相互作用研究

李如月 戴國(guó)梁 楊欣怡 陳閃閃 曹 陽(yáng) 劉美琛 王一清 李斐然 居文政

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京 210029）

抑郁癥是一種心理或情感障礙疾病，主要表現(xiàn)為心情低落、興趣減低、思維遲緩、認(rèn)知功能受損，具有高發(fā)病率、高致殘率和高自殺率的特點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2030年抑郁癥將成為全球疾病負(fù)擔(dān)第一位的病種[1]。抑郁癥病因病機(jī)復(fù)雜、類(lèi)型多樣、伴發(fā)癥狀多，臨床治療常采用綜合療法，其中中藥在改善癥狀、減輕不良反應(yīng)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等方面具有較好的效果[2]。研究顯示，中西藥聯(lián)用在治療抑郁癥方面優(yōu)于單用西藥，起效時(shí)間快、臨床療效較好且安全性高[3-4]。

貫葉連翹的主要成分為金絲桃素和貫葉金絲桃素，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明貫葉連翹具有抗抑郁、抗病毒、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛等作用[5]。貫葉連翹在歐洲用于治療抑郁癥已有百余年歷史且療效確切[6]，其可能通過(guò)抑制5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）和去甲腎上腺素（NE）的再攝取，產(chǎn)生抗抑郁作用[7-8]。舍曲林是選擇性5-HT再攝取抑制劑（SSRI）的代表藥物之一，臨床用于抑郁癥的治療，療效確切，但起效較慢。課題組對(duì)貫葉連翹與舍曲林聯(lián)用改善皮質(zhì)酮誘導(dǎo)大鼠抑郁樣行為的效果及機(jī)制進(jìn)行了研究，同時(shí)通過(guò)藥代動(dòng)力學(xué)研究，揭示舍曲林在正常大鼠體內(nèi)、舍曲林聯(lián)合貫葉連翹和單獨(dú)給藥在抑郁模型大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的差異，以期能為臨床合理用藥提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（220±10）g，購(gòu)自南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2019-0001，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，保持12 h晝夜節(jié)律，室溫（22±2）℃，自由攝食飲水。本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)（批件號(hào)：2022DW-08-02）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Waters Quattro Micro液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）；Masslynx 4.0色譜工作站；CPA225D型 電子天平（德國(guó)Sartorius）；Legend Micro17R型冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；Drict-Q5超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；WH-2微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠(chǎng)）；Labconco離心濃縮儀（美國(guó)Labconco公司）；KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀Rayto RT-6100（美國(guó)Thermo公司）。

1.3 藥物與試劑 貫葉連翹提取物片（德國(guó)拜耳制藥，規(guī)格：900 mg/片，生產(chǎn)批號(hào)：6041810）；鹽酸舍曲林片（輝瑞制藥有限公司，規(guī)格：50 mg/片，生產(chǎn)批號(hào)：DH7541）；皮質(zhì)酮（CORT，梯希愛(ài)上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；舍曲林標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：100702-201602，規(guī)格：50 mg）和替米沙坦標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：100629-201803，規(guī)格：100 mg/支）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度經(jīng)HPLC法檢測(cè)均大于99.0%；大鼠5-HT、NE、DA和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、分組與給藥 將雄性SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組與造模組，造模組大鼠采用皮下注射20 mg/kg皮質(zhì)酮（以0.1%二甲基亞砜和0.1%吐溫80生理鹽水為溶媒）的方法建立抑郁癥模型，空白組皮下注射相同劑量的溶媒，每日1次于上午9∶00—11∶00之間注射，連續(xù)21 d。隨后所有大鼠進(jìn)行糖水偏好試驗(yàn)，造模組大鼠糖水消耗率明顯低于空白組，說(shuō)明造模成功。將造模組和空白組大鼠分別隨機(jī)分為8組，每組6只。其中藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)5組，分別為空白組、模型組、舍曲林組（20 mg/kg）、貫葉連翹組（90 mg/kg）、貫葉連翹和舍曲林聯(lián)用組（給藥劑量同單用組）；藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)3組，分別為空白舍曲林組（20 mg/kg）、模型舍曲林組（20 mg/kg）、模型貫葉連翹和舍曲林聯(lián)用組（貫葉連翹90 mg/kg、舍曲林20 mg/kg）。

藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)各組于造模完成后第2日開(kāi)始，連續(xù)灌胃給予藥物或等量溶劑14 d，每日于同一時(shí)間灌胃1次。藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)，于造模完成后第2日開(kāi)始模型貫葉連翹和舍曲林聯(lián)用組連續(xù)灌胃給藥貫葉連翹提取物14 d，其余2組灌胃等量溶劑，在灌胃開(kāi)始后第15日3組大鼠灌胃給予舍曲林1次。

2.2 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 糖水偏好試驗(yàn) 分別于造模完成后與給藥結(jié)束后對(duì)各組大鼠進(jìn)行糖水偏好試驗(yàn)。試驗(yàn)前讓大鼠提前適應(yīng)2 %蔗糖水1 d，隨后禁水18 h，每只大鼠給予1瓶500 mL 2%蔗糖水溶液和1瓶純凈水，測(cè)試4 h，其中2 h后2瓶交換位置，測(cè)試結(jié)束后計(jì)算糖水消耗率。糖水消耗率（%）=糖水?dāng)z入量/（糖水?dāng)z入量+純凈水?dāng)z入量）×100%，其中糖水或純凈水?dāng)z入量均按克（g）計(jì)。

2.2.2 體質(zhì)量檢測(cè) 分別于造模完成后與給藥結(jié)束后按照動(dòng)物編號(hào)對(duì)各組大鼠進(jìn)行稱(chēng)重，記錄體質(zhì)量。

2.2.3 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn) 給藥結(jié)束后對(duì)各組大鼠進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)。試驗(yàn)前進(jìn)行游泳適應(yīng)，將大鼠置于（24±2）℃水桶中，保持大鼠懸浮，四肢不能接觸桶底，試驗(yàn)過(guò)程中保持安靜。次日在相同條件下強(qiáng)迫游泳5 min，記錄后4 min的大鼠不動(dòng)時(shí)間，即大鼠僅有頭部露出水面，呈漂浮狀態(tài)，四肢可有微動(dòng)狀態(tài)的時(shí)間。

2.2.4 動(dòng)物取材及樣本處理 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠采用10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，1530×g離心10 min后取血清，-80 ℃冰箱保存待測(cè)。隨后大鼠頸椎脫臼法處死，冰上快速分離海馬組織，液氮速凍后存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱備用。

2.2.5 ELISA檢測(cè)大鼠海馬及血清中5-HT、DA、NE及BDNF水平 取大鼠海馬組織和血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法檢測(cè)各組大鼠海馬組織和血清中5-HT、DA、NE和BDNF水平。

2.3 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱，流動(dòng)相：乙腈/0.1%甲酸（41∶59）；流速為0.2 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧（ESI）離子源，噴霧電壓為3500 V，溫度320 ℃。陽(yáng)離子方式掃描，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。m/z：305.9 →158.6（舍曲林）；m/z：515.1→276.0（替米沙坦）。

2.3.3 動(dòng)物取材及樣本處理 各組大鼠于舍曲林給藥 后0、0.25、0.35、1.25、3、4、5、6、8、9、10、11、12、16、24 h眼眶取血約0.25 mL，肝素鈉抗凝，1530×g離心10 min，取上層血漿保存于-80 ℃冰箱備測(cè)。

2.3.4 血漿樣品處理 血漿樣品于室溫下解凍，精密吸取100 μL至1.5 mL離心管，加入濃度為500 ng/mL內(nèi)標(biāo)替米沙坦10 μL，渦旋10 s，加入800 μL乙酸乙酯，振蕩3 min，13 800×g離心10 min，取750 μL上清液至另一個(gè)離心管，置于離心濃縮儀揮干后用100 μL流動(dòng)相溶解，取10 μL于具內(nèi)襯管的進(jìn)樣瓶中運(yùn)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測(cè)定血漿中舍曲林含量。

2.3.5 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算 根據(jù)LC-MS/MS所得數(shù)據(jù)，采用DAS 2.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：半衰期（t1/2）、達(dá)峰時(shí)間（Tmax）、血藥峰濃度（Cmax）、藥時(shí)曲線(xiàn)下面積[AUC（0-t）和AUC（0-∞）]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0軟件通過(guò)單因素方差分析（One-Way ANOVA）對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，計(jì)量數(shù)據(jù)用（）表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用DAS 2.0軟件計(jì)算，結(jié)果用（）表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

3.1.1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較 除空白組外，其余各組大鼠造模完成后糖水消耗率、體質(zhì)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明基線(xiàn)平衡。干預(yù)結(jié)束后，模型組大鼠糖水消耗率、體質(zhì)量顯著低于空白組（P＜0.01，P＜0.05），游泳不動(dòng)時(shí)間顯著高于空白組（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組上述行為學(xué)指標(biāo)均有顯著改善（P＜0.05，P＜0.01）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠干預(yù)結(jié)束后行為學(xué)指標(biāo)比較（）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.1.2 各組大鼠海馬組織和血清5-HT、NE、DA和BDNF水平比較 與空白組比較，模型組大鼠海馬和血清5-HT、DA、NE和BDNF水平顯著降低（P＜0.01）。貫葉連翹組大鼠海馬組織5-HT、DA、BDNF水平和血清NE水平，舍曲林組海馬組織DA水平，貫葉連翹和舍曲林聯(lián)用組海馬組織5-HT、DA、NE、BDNF水平和血清5-HT、NE水平均顯著高于模型組（P＜0.05）；貫葉連翹和舍曲林聯(lián)用組海馬組織5-HT水平顯著高于貫葉連翹組、舍曲林組（P＜0.05，P＜0.01），海馬組織NE、BDNF和血清5-HT、NE水平顯著高于舍曲林組（P＜0.05，P＜0.01）。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠海馬組織和血清5-HT、DA、NE和BDNF水平比較（）

表2 各組大鼠海馬組織和血清5-HT、DA、NE和BDNF水平比較（）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與貫葉連翹組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與舍曲林組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

3.2 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn) 3組大鼠灌胃給予舍曲林后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3，血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。與空白舍曲林組比較，模型舍曲林組大鼠血漿中舍曲林Cmax、AUC（0-t）和AUC（0-∞）顯著增加（P＜0.01，P＜0.05）；與模型舍曲林組比較，模型貫葉連翹和舍曲林聯(lián)用組舍曲林Tmax顯著降低（P＜0.05），Cmax、AUC（0-t）和AUC（0-∞）顯著增加（P＜0.01）。另外，由分析結(jié)果可知，舍曲林在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)符合一室開(kāi)放模型。

表3 各組大鼠血漿舍曲林藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較（）

表3 各組大鼠血漿舍曲林藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較（）

注：與空白舍曲林組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型舍曲林組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

圖1 各組大鼠體內(nèi)舍曲林平均血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)（n=6）

4 討論

對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物重復(fù)注射皮質(zhì)酮已經(jīng)被公認(rèn)是一個(gè)可靠的制作慢性應(yīng)激性抑郁障礙動(dòng)物模型的方法[9]。皮質(zhì)酮重復(fù)皮下注射給藥可以誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為，下調(diào)海馬區(qū)5-HT水平[10]，還可以降低海馬組織內(nèi)的BDNF表達(dá)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證明皮質(zhì)酮皮下注射制作抑郁癥大鼠模型成功。

5-HT受體是單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)受體的一部分，單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)受體的降低是抑郁癥發(fā)病的重要原因[1]。研究表明，5-HT、NE和DA等神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)情緒、心理壓力的反應(yīng)性、自我控制、動(dòng)機(jī)、驅(qū)動(dòng)力和認(rèn)知表現(xiàn)產(chǎn)生重大影響[12]。研究發(fā)現(xiàn)，5-HT、NE和DA在抑郁癥患者血清中的表達(dá)明顯低于正常人，且含量越低臨床癥狀越嚴(yán)重[13]。隨著對(duì)抑郁癥發(fā)病機(jī)制更為深入的研究，腦內(nèi)海馬區(qū)BDNF的表達(dá)異常也逐漸受到重視[14]。BDNF是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)分布最廣、含量最高的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)域[15]。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，在大鼠海馬組織中，舍曲林組只有DA水平顯著回調(diào)，貫葉連翹組5-HT、DA和BDNF水平有顯著回調(diào)，貫葉連翹和舍曲林聯(lián)用組5-HT、DA、NE和BDNF水平都有顯著回調(diào)；在血清中，舍曲林組大鼠上述4個(gè)指標(biāo)均無(wú)顯著變化，貫葉連翹組只有NE水平顯著回調(diào)，貫葉連翹和舍曲林聯(lián)用組5-HT和NE水平有顯著回調(diào)。舍曲林組5-HT水平雖然較模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是也有回調(diào)趨勢(shì)，可能與舍曲林起效時(shí)間長(zhǎng)有關(guān)。各給藥組之間比較，貫葉連翹和舍曲林聯(lián)用組大鼠海馬組織5-HT水平顯著高于2個(gè)單獨(dú)給藥組，血清5-HT水平顯著高于舍曲林組，可能由于兩種藥物作用機(jī)制相似，都能抑制5-HT的再攝取，從而在聯(lián)合治療時(shí)5-HT水平改善更為顯著。綜合以上結(jié)果，雖然部分指標(biāo)組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是整體看來(lái)4項(xiàng)指標(biāo)經(jīng)藥物干預(yù)均有回調(diào)趨勢(shì)，其中貫葉連翹和舍曲林聯(lián)用組改善最為明顯。

藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，模型舍曲林組的Cmax、AUC（0-t）和AUC（0-∞）分別是空白舍曲林組的1.48、1.50、1.50倍，模型貫葉連翹和舍曲林聯(lián)用組的Cmax，AUC（0-t）和AUC（0-∞）分別是模型舍曲林組的1.62、1.53、1.53倍，Tmax僅為其的0.67倍，說(shuō)明聯(lián)合使用了貫葉連翹后，縮短了舍曲林的起效時(shí)間，提高了吸收率，生物利用度更高。舍曲林在體外與P糖蛋白（P-gp）具有很高的親和力[16]，而P-gp表達(dá)的缺失可能導(dǎo)致抑郁癥[17]，因此抑郁狀態(tài)下P-gp下調(diào)可能導(dǎo)致舍曲林在血漿中暴露量增加。另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道，貫葉連翹提取物的一種有效成分貫葉金絲桃素能夠抑制P-gp的外排[18]，這也可能導(dǎo)致舍曲林在血漿中的暴露量增加。有文獻(xiàn)報(bào)道，貫葉連翹雖可以誘導(dǎo)CYP2C19活性[19]，但是抑郁狀態(tài)下的大鼠單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、炎癥因子增加等病理狀態(tài)，也可能導(dǎo)致體內(nèi)的一些代謝酶活性的變化[20]，從而導(dǎo)致體內(nèi)血藥濃度的變化。因此，我們推測(cè)，在大鼠抑郁狀態(tài)下，與單用舍曲林相比貫葉連翹與舍曲林聯(lián)合應(yīng)用后舍曲林在血漿中暴露量發(fā)生了顯著性變化，可能是一種或者多種因素共同作用的結(jié)果，其具體作用機(jī)制可應(yīng)用Cocktail探針和Western Blot方法分別證實(shí)，這是我們下一步的研究方向。值得注意的是，抑郁癥狀態(tài)下也可能導(dǎo)致血藥濃度發(fā)生變化，提示臨床上對(duì)抑郁癥患者的用藥劑量要及時(shí)調(diào)整。

抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、影響因素較多，西藥多數(shù)只針對(duì)單一機(jī)制治療，存在著治療效果差、起效時(shí)間長(zhǎng)、不能涵蓋所有抑郁類(lèi)型等不足。中西藥聯(lián)合應(yīng)用具有多機(jī)制、多靶點(diǎn)共同作用的優(yōu)勢(shì)，已成為臨床治療抑郁癥的有效手段。不同的藥物聯(lián)合應(yīng)用，其抗抑郁作用可能增加，但是由于藥物相互作用，也可能降低療效甚至產(chǎn)生毒副作用。本研究結(jié)果表明，貫葉連翹和舍曲林聯(lián)合應(yīng)用對(duì)改善皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的大鼠抑郁樣行為有較好的作用，且起效時(shí)間短，對(duì)癥狀和血清學(xué)指標(biāo)的改善效果優(yōu)于單用舍曲林或貫葉連翹，結(jié)合藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)其可能的原因是由于二者聯(lián)合用藥后舍曲林在血漿中暴露量增加，也可能由于二者聯(lián)合用藥協(xié)同增效。本實(shí)驗(yàn)的給藥劑量為臨床等效劑量，實(shí)際臨床中如何控制好量效關(guān)系，使之最優(yōu)化也至關(guān)重要，這也是我們下一步的研究方向。