白術內生真菌AM569對3種鐮刀菌的拮抗作用及其ITS分子鑒定

吳啟婷， 任航潔， 秦曄， 徐丹， 王雪怡， 秦路平， 朱波

(浙江中醫(yī)藥大學 藥學院，浙江 杭州 310053)

藥用白術為菊科植物白術(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖[1]，始載于《神農本草經(jīng)》，被列為上品，性溫、味苦，入脾、胃經(jīng)，具健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎等功效，臨床多用于脾虛食少、痰飲眩悸、腹脹泄瀉、水腫、自汗、胎動不安等癥狀[2]。現(xiàn)代藥理學研究表明，白術具有保肝、促進腸胃蠕動、治療便秘、潰瘍性急腸炎、提高免疫功能、增強脂代謝，抗炎抗腫瘤、降血糖等藥理活性[3]。

內生真菌是指在生活史的某一個階段能侵染并定殖在健康植物組織內部，且不會引起宿主植物明顯病癥的一類真菌[4]。近年來研究表明，幾乎所有的植物體內都存在著內生真菌，植物內生真菌與宿主植物協(xié)同進化，互惠共生，在植物生長發(fā)育、抗逆脅迫等方面發(fā)揮著重要作用[5-6]。研究表明，部分植物內生真菌對植物病原菌具有拮抗作用。周春元等[7]從健康人參葉片中分離得到的一株優(yōu)勢內生真菌FS-01(球毛殼菌Chaetomiumglobosum)，其對人參黑斑病菌具有較強的抑制作用。楊濤等[8]從華重樓種子中分離到了一株內生真菌聚多曲霉jdqmzz-1(Aspergillussydowii)，其對根腐病病原菌尖孢鐮刀菌、軟腐病病原菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌具有較好的拮抗作用。

根腐病是白術生產(chǎn)栽培中主要的土傳性病害之一，危害嚴重，是白術生產(chǎn)種植鏈中亟待解決的問題。白術根腐病病原菌為復合性病原菌，主要為鐮刀菌屬真菌，包括尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)和半裸鐮刀菌(Fusariumincarnatum)等[9]。目前，栽培管理中白術根腐病主要依靠化學農藥防治，易導致環(huán)境污染、農藥殘留以及病原菌耐藥性等問題[10]。因此，本試驗在前期分離得到的32株白術內生真菌的基礎上，采用平板對峙法考察內生真菌對3種根腐病病原菌的拮抗作用，進一步選取活性菌株進行發(fā)酵產(chǎn)物制備，考察發(fā)酵產(chǎn)物對根腐病病原菌的拮抗作用，并最后對活性菌株進行ITS分子鑒定，以期為白術根腐病的生物防治提供備選菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

課題組前期從白術新鮮組織中分離純化得到32株內生真菌。白術根腐病病原菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum，F(xiàn)O)、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani，F(xiàn)S)、半裸鐮刀菌(Fusariumincarnatum，F(xiàn)I)由浙江農林大學陳杰研究員惠贈。

1.1.2 儀器與試劑

SW-CJ-2D垂直型超凈臺(中科星宇科技發(fā)展有限公司)；LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋(山東博藍達機械有限公司)；B2-25型恒溫搖床(上海立德泰勀科學儀器有限公司)；PN-CCS 10 L型超純水儀(美國Millipore公司)；DHG-9031A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信試驗儀器有限公司)；FA2004型電子分析天平(上海恒平精密電子儀器有限公司)；TC1000-S型PCR儀(上海藝斯高貿易有限公司)；HC-1016/1014型高速離心機(上海浦東天本離心機械有限公司)；海爾BCD-258WDPM型冰箱(青島海爾股份有限公司)；DYCZ-25D型電泳儀(南京金斯瑞生物科技有限公司)；ZF-268型凝膠成像系統(tǒng)(北京原平皓生物技術有限公司)；FYL-YS真菌培養(yǎng)箱(北京福意聯(lián)醫(yī)療設備有限公司)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基(1 L)組成為：土豆200 g、瓊脂15 g、葡萄糖20 g、青霉素鈉50 mg、純水1 000 mL。PDB液體培養(yǎng)基(1 L)組成為：土豆200 g、葡萄糖20 g、青霉素鈉50 mg、純水1 000 mL。其余試劑包括NaClO溶液，乙醇，葡萄糖，DNATaq酶，脫氧核糖三磷酸(dNTP)，MgCl2，10×PCR反應緩沖液等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌與內生真菌的平板對峙

采用平板對峙法考察32株內生真菌對3種白術根腐病病原菌(FO，F(xiàn)S，F(xiàn)I)的拮抗活性。在PDA平板中央接種直徑為5 mm的病原菌菌塊，以120°為夾角，在距病原菌菌株20 mm的3個直線方向的等距位置接種直徑為5 mm的內生真菌菌塊，以不接種內生真菌的病原菌平板為空白對照，待對照組病原菌長滿平板后，測量各組病原菌菌落直徑，計算抑菌率=(對照組病原菌菌落直徑-處理組病原菌菌落直徑)/對照組病原菌菌落直徑×100%，試驗重復3次。

1.2.2 AM569發(fā)酵產(chǎn)物的制備

挑取AM569菌株單菌落接種于馬鈴薯葡萄糖水(PDB)液體培養(yǎng)基中，在26 ℃、180 r·min-1恒溫條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)8 d。取發(fā)酵液抽濾，將濾液以乙酸乙酯∶濾液1∶1的比例萃取3次，旋蒸至浸膏狀。同時，將菌絲放置于50 ℃烘箱中烘至恒重，研磨成粉末，以甲醇(mL)∶菌絲粉末(g)20∶1的比例超聲提取1 h，抽濾得菌絲甲醇提取液。將菌絲甲醇提取液與發(fā)酵濾液浸膏混合，適量甲醇超聲溶解，旋蒸至浸膏狀，加入適量二甲基亞砜(DMSO)助溶，用甲醇定容至10 mL，即得AM569發(fā)酵產(chǎn)物。

1.2.3 AM569發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性檢測

取AM569浸膏加入PDA固體培養(yǎng)基中(濃度為10 mg·mL-1)，在平板中央接種直徑為5 mm的3種病原菌菌株，設10 mL無菌水為陰性對照組，多菌靈500倍液為陽性對照組，5 mL DMSO+5 mL甲醇為陽性溶劑對照組，計算抑菌率，試驗重復3次。

1.2.4 AM569的ITS分子鑒定

使用真菌基因組DNA提取試劑盒，以無菌水沖洗3次菌絲體，進行冷凍干燥，提取AM569的DNA[11]。采用通用引物ITS4(5′-GGAAGTAA AAGTCGTAAGG-3′)與ITS5(5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′)進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，得到的序列在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索同源序列，并進行BLAST比對，用于系統(tǒng)發(fā)育分析[12]，使用Mega7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建[13]，明確AM569的系統(tǒng)分類地位。

2 結果與分析

2.1 病原菌與拮抗菌的對峙結果

在32株白術內生真菌中，對FO、FS、FI病原菌有抑制作用的內生真菌分別有9株、11株、21株，占比分別為28.1%、34.4%、65.6%；共26株內生真菌至少對一種白術根腐病病原菌具有抑制作用，占總數(shù)的81.2%。對3種病原菌均有抑制作用的內生真菌共3株，為AM171、AM262和AM569；其中，AM569綜合抑菌效果最好，對FO、FS、FI抑菌率分別為74.3%、77.5%和70.4%(表1，圖1)。

2.2 AM569發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性檢測

AM569發(fā)酵產(chǎn)物對3種白術根腐病病原菌FO、FS、FI的抑菌率如表2所示。AM569、多菌靈對病原菌FO、FS的抑菌率都是100.00%，與無菌水對照組均有顯著性差異；溶劑DMSO+甲醇組對FO、FS組抑菌率分別為31.76%和68.24%，與AM569組、無菌水組均有顯著差異。AM569對病原菌FI的抑菌率為100.00%，多菌靈對病原菌FI的抑菌率為23.53%，溶劑DMSO+甲醇組對FI的抑菌率為8.82%，與AM569組、無菌水組均有顯著性差異(表2)。綜上所述，AM569發(fā)酵產(chǎn)物對FO、FS、FI均具有顯著的抑菌性(圖2)。DMSO+甲醇溶劑對FS具有較強的抑菌作用，在后續(xù)試驗中，針對FS應考慮乙醇等為提取溶劑，以減少溶劑對試驗結果的干擾。

表1 對FO、FS、FI 3種病原菌的抑菌效果

2.3 內生真菌AM569的分子鑒定

將AM569序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，下載與DNA序列相似的14個序列作為參考菌株序列，再選擇Ditopellasp.(EU683067)作為外群，進行系統(tǒng)發(fā)育關系分析[14]。結果顯示，AM569與Phomopsisasparagi(KX866925)、Phomopsiseucommii(AY601921)聚在一起，形成了一個支持強度為100%的末端分支(圖3)，所以將AM569鑒定為擬莖點霉屬(Phomopsissp.)真菌。

圖1 AM06、AM569對3種白術根腐病病原菌的平板抑制作用

表2 AM569發(fā)酵產(chǎn)物對3種白術根腐病病原菌的抑菌活性

圖2 AM569發(fā)酵產(chǎn)物對3種鐮刀菌FO、FS、FI的平板抑制效果

圖3 基于ITS序列的白術內生真菌AM569系統(tǒng)發(fā)育樹

3 小結與討論

本試驗從32株白術內生真菌中篩選得到一株內生真菌AM569，其發(fā)酵產(chǎn)物對3種白術根腐病病原菌(Fusariumoxysporum，F(xiàn)O；Fusariumsolani，F(xiàn)S；Fusariumincarnatum，F(xiàn)I)具有顯著的抑制作用。經(jīng)ITS分子鑒定，AM56為擬莖點霉屬(Phomopsis)真菌，該菌株已保存至中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC No.21947。

近年來已報道許多具有拮抗病原菌作用的內生真菌，如藍莓健康組織中分離純化的枝孢菌屬(Cladosporiumsp.)內生真菌BB01可抑制4種藍莓病害菌生長[15]，從滇重樓塊莖中分離的8株內生真菌對植物病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有一定的抑制作用[16]。本試驗發(fā)現(xiàn)白術內生真菌對白術根腐病致病菌有顯著的抑菌性，可進一步研究開發(fā)微生物農藥，利用生物防治手段科學有效地防控白術根腐病，提高白術藥材的產(chǎn)量和品質。植物內生真菌發(fā)酵產(chǎn)物往往具有較好的抗病原菌作用，如來源于核桃樹根部的一株內生真菌G3(Fusariumcamptoceras)，其發(fā)酵產(chǎn)物對蘋果腐爛病原菌、水稻紋枯病原菌、核桃炭疽病原菌均表現(xiàn)出良好的抑菌活性[17]。苦參內生真菌BS001(Aspergilluterreus)對黃瓜枯萎病菌具有顯著的抑菌效果，BS001菌株發(fā)酵液中的抗菌活性物質能抑制黃瓜枯萎病菌絲的生長，同時抑制孢子萌發(fā)，對黃瓜枯萎病病原菌合成梭甲基纖維素酶有抑制作用，并且可以使細胞膜結構受損，從而能很好地抑制黃瓜枯萎病[18]。溫郁金內生真菌ChaetomiumglobosumL18對玉米大斑病菌、禾谷鐮孢菌等多種植物病原真菌均有不同程度的抑制作用，抑菌譜較廣泛，可以通過侵入、穿透、纏繞等多種方式寄生于病原真菌菌絲，通過酶解作用破壞病原真菌細胞壁，導致病原真菌死亡[19]。

擬莖點霉屬(Phomopsissp.)是半知菌亞門、腔孢綱、球殼孢目、球殼孢科(Annonaceae)的真菌，顯著特征是分生孢子呈現(xiàn)二型性及僅有無性生殖，該屬已記錄有100多個種，可寄生于70多個不同科的草本和木本植物[20]。擬莖點霉屬真菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物對許多種植物病原菌均具有良好的抑菌效果，其在防治農作物病害上具有廣闊的應用前景。李芙蓉等[21]從丹參中分離篩選得到的擬莖點霉屬真菌(Phomopsissp.S4)，其發(fā)酵液提取物可以對稻瘟病菌絲的細胞壁造成破壞，從而干擾了菌絲正常的生理功能，進而抑制了稻瘟病菌的生長。

本試驗發(fā)現(xiàn)，從白術中分離得到的擬莖點霉屬內生真菌AM569對白術根腐病菌具有較強的抑菌活性，具有較大的開發(fā)應用價值，為今后生物防治白術根腐病的微生物制劑開發(fā)奠定基礎。下一步擬對AM569發(fā)酵產(chǎn)物中的活性物質進行分離鑒定，以尋找目標活性化合物，為微生物菌劑的開發(fā)與利用提供優(yōu)質的先導活性物質。