解鉀細菌的分離篩選及其對水稻的促生效果

俞海平， 傅慶林， 劉俊麗， 林義成， 郭彬， 劉琛*

(1.紹興市上虞區農業技術推廣中心，浙江 紹興 312300； 2.浙江省農業科學院 環境資源與土壤肥料研究所，浙江 杭州 310021)

鉀在水稻體內參與了光合作用、碳水化合物的轉運、蛋白質合成等過程[1]。每季水稻鉀吸收量為155.2 kg·hm-2，缺鉀會抑制水稻的生長發育，降低水稻的產量和品質[2-3]。土壤中鉀素含量豐富，但多以礦物鉀和固定鉀形式存在，不能被植物直接吸收。據報道，我國耕地鉀素有效性較低，加之高強度的利用，作物收獲帶走了大量鉀素，進一步加劇了土壤鉀缺乏[4]。我國水稻主產區最佳施鉀量為45～80 kg·hm-2，但我國鉀礦資源稀少，50%～70%的鉀肥都依賴進口，農業生產中鉀肥施用量往往不足[5-6]。使用生物肥料替代傳統化肥可以有效減少化肥使用，降低生產成本，促進生態友好型作物的生產。

許多研究表明，解鉀細菌能分解含鉀礦物，將土壤中的無效鉀轉化為速效養分，增加土壤中鉀元素的含量[7]。葛紅蓮等[8]研究發現，用解鉀細菌可顯著提高黃瓜的根長、株高和質量。陳臘等[9]研究結果表明，接種解鉀菌可以增加拔節期、吐絲期玉米的株高、地上生物量、葉面積指數和葉綠素。一方面，解鉀菌產生的有機酸和無機酸可以通過降低其周圍環境的pH，直接促進含鉀礦物的風化，導致可交換性鉀的緩慢釋放，提高環境速效鉀含量；另一方面，解鉀菌可通過分泌多糖黏附于含鉀礦物表面從而形成特殊的微環境來促進其解鉀功能的發揮[10]。

本研究針對浙江地區紅壤及氣候特點，從水稻根際土中分離篩選高效解鉀菌，通過盆栽試驗研究其對水稻的促生潛力，同時將菌株與具有促磷吸收效應的叢枝菌根真菌進行混合培養，研究他們之間的互作效應，以期為微生物鉀肥研發提供優良菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤樣品為浙江省建德市水稻根際土壤，裝入無菌自封袋中，貼上標簽，運回實驗室進行解鉀菌的分離。試驗用培養基為亞歷山大硅酸鹽細菌培養基和牛肉膏蛋白胨培養基[11]。

1.2 解鉀細菌的分離和篩選

稱取5 g土壤的樣品，加入45 mL無菌水，振蕩約20 min后靜置備用。按照梯度稀釋法進行分離。挑選清晰且具有明顯解鉀圈的單個菌落，在解鉀培養基上劃線純化。根據菌落四周有無透明圈和可溶性指數大小篩選高效解鉀菌(可溶性指數=水解圈直徑D/菌落直徑d)[9]。篩選后的菌株4 ℃保存在斜面培養基上，對其進行鑒定和促生效果驗證。

1.3 解鉀細菌的鑒定

參照文獻[12]對解鉀細菌進行菌種鑒定，鑒定內容包括菌株的培養特征、形態學觀察、革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色以及菌種的生理生化測定。按照細菌基因組提取試劑盒說明書(Rapid Bacterial Genomic DNA Isolation Kit)提取供試菌株的總基因組DNA，采用16S rRNA基因通用引物對27F/1492R進行PCR擴增[9]，將PCR產物送生工生物科技(上海)有限公司進行測序。得到的16S rDNA序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)網站上進行BLAST序列比對分析，使用MEGA 7.0軟件采用鄰接法構建系統發育樹，發育樹用Bootstrap法(1 000次)重復檢驗。

1.4 解磷菌株對水稻生長的影響

1.4.1 處理設計

試驗設置不接種處理為對照；接種解鉀菌JK4(解鉀菌處理)；接種叢枝菌根真菌(解磷菌處理)；同時接種叢枝菌根真菌和解鉀菌JK4(組合菌處理)。每個處理3個重復。供試水稻品為甬優7872。

土壤有機質含量為12.3 g·kg-1，全氮含量為1.18 g·kg-1，速效磷含量為8.34 mg·kg-1，速效鉀含量為76.8 mg·kg-1，pH 6.8。

1.4.2 測定指標

土壤速效鉀、有效磷，以及植株中氮、磷、鉀含量分別按照標準NY/T 889—2004、NY/T 1121.7—2014、NY/T 2017—2011測定。

1.5 數據分析

試驗數據采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，多重比較采用Turkey檢驗(α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 土壤解鉀細菌的篩選

從根際土壤中分離出5株解鉀細菌，分別命名為JK1、JK2、JK3、JK4和JK5。采用以鉀長石粉為唯一鉀源的培養基對菌株的解鉀能力進行測定，其中JK4的解鉀圈最大，可溶性指數達到3.37(表1)。選擇JK4進行后續研究。

表1 菌株在解鉀培養基上的可溶性指數

2.2 解鉀細菌的鑒定

菌落圓形，凸起，光滑，邊緣整齊，表面光滑，無色透明。革蘭氏染色陰性，菌體桿狀，兩端鈍圓，有莢膜，菌體中央產生橢圓形芽孢，依據《伯杰氏細菌鑒定手冊》，初步鑒定為芽胞桿菌。

將測序獲得的供試菌株的16S rRNA基因序列進行BLAST比對，根據比對結果，下載同源性最近的菌株和株外源菌株的序列，和測試菌株一起采用鄰接法構建系統發育樹，如圖1所示。JK4與Paenibacillusmucilaginosus序列相似性為99.8%，屬于膠質芽孢桿菌屬。

2.3 解鉀細菌對水稻的促生作用

接種JK4后水稻的籽粒和秸稈的全鉀含量分別為3.44 g·kg-1和34.7 g·kg-1，與不接種對照相比，分別提高0.15 g·kg-1和5.70 g·kg-1。土壤有效鉀含量為140.3 mg·kg-1，而對照僅為75.7 mg kg-1，達到顯著性差異。結果表明，解鉀菌株對水稻具有較好的促生作用。

叢枝菌根真菌處理水稻的籽粒和秸稈的全磷含量分別為3.24 g·kg-1和1.79 g·kg-1，與對照相比，分別提高0.41 g·kg-1和0.24 g·kg-1。土壤有效磷含量為17.7 mg·kg-1，而對照僅為12.7 mg·kg-1，達到顯著性差異(表2)。圖2表明，叢枝菌根真菌可以促進水稻對磷的吸收。但同時接種解鉀菌和叢枝菌根真菌后，土壤速效鉀與對照差異不明顯。

柱上無相同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)。圖2 接種菌對土壤速效養分含量的影響

3 小結與討論

近年來，由于鉀肥價格較高，加之農民偏重施氮磷肥，輕視鉀肥的作用，導致稻田鉀素虧缺，對水稻增產潛力和土壤健康造成不利影響[13]。研究表明，解鉀菌對含鉀硅酸礦物具有分解作用，可以提高土壤鉀的有效性，促進植物根系吸收利用，達到提高作物產量和品質的目的[14]。不少學者針對不同作物篩選的解鉀菌，其解鉀能力受土壤類型、鉀礦類型、土壤pH、鉀離子濃度等諸多因素的影響[15]。如趙君等[16]從南方紅壤區杉木人工林根際土壤中篩選出的解鉀菌解鉀率為60.49%，宋聰等[17]篩選的解鉀菌發酵15 d后，發酵液中可溶性鉀含量達到37.77 mg·L-1，吳紅艷等[18]從番茄土壤中篩選的解鉀菌K02發酵液中可溶性鉀含量高達41.84 mg·L-1。應用高效的解鉀菌可以改善多種作物的生長、抗逆性品質和產量。朱娟娟等[19]發現解鉀菌能夠提高枸杞葉片類黃酮、熒光激發比花青素相對指數、花青素和氮素平衡指數，降低O2·-和H2O2含量，增加可溶性糖含量及過氧化氫酶、蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶和轉化酶活性，緩解鹽脅迫對枸杞幼苗的影響。這些研究說明，應用高效的解鉀菌可以改善作物的生長。本研究中接種解鉀菌后土壤有效鉀含量相比對照增加了64.6 mg·kg-1，達到顯著性差異，說明解鉀菌可以活化土壤中的無效鉀，從而提高土壤鉀的生物有效性。本研究各處理水稻籽粒的全鉀含量無顯著差異。Xu等[2]分析了2 216份水稻籽粒樣品，發現水稻籽粒鉀含量在0.31%，因此，水稻吸收的鉀主要存儲在營養器官(秸稈)中，籽粒中相對較少，說明水稻籽粒鉀含量一般不受鉀肥施用量的影響，主要由基因型決定[20]。

劉曉倩等[21]研究結果表明，混合施用解磷菌、解鉀菌使土壤過氧化氫酶、脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶4種生物酶類活性分別比對照提高了40.2%、95.6%、119.4% 和 29.0%，顯著增加烤煙的產量和產值。楊冬艷等[22]研究發現，溶磷菌和解鉀菌配施產生了疊加效應，土壤速效氮、磷、鉀含量顯著高于其他處理。而在本研究中，解鉀菌與叢植菌根真菌混施后，僅促進了磷的活化，但對鉀的影響不顯著。可能是由于解鉀菌與叢植菌根真菌混配后產生了競爭關系，不利于解鉀菌在根部的定植和存活。因此，掌握這些微生物之間的相互作用，將幾種微生物有機混合在一起，確定菌劑的最佳組合，對微生物菌肥的開發利用有重要意義。