芪參益氣滴丸含藥血清抑制血管平滑肌細胞增殖作用的實驗研究

張新穎

（天津市第四中心醫院中醫科，天津 300241）

中藥復方研究注重中藥作用整體性，往往局限于臨床研究及動物實驗研究[1]。有研究顯示，直接應用中藥復方作用于實驗細胞后，細胞出現大量死亡現象。另有學者認為，中藥在臨床應用過程中常以復方形式治療疾病，復方經過人體的消化與吸收后發揮藥效可能不同于中藥單一的作用效果。目前，中藥血清藥理學與血清藥理化學的研究[2]及兩者的相結合成為最新的研究熱點，為中藥復方研究及發展提供了新的研究方向[3]。本實驗中提取中藥復方含藥血清作用于細胞實驗中，探索細胞研究中的方法及應用，旨在為研究者開展血清藥理學研究提供相應的理論與方法支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD 大鼠11 只，體重180～220 g，6～8 周齡，由北京軍事醫學科學院實驗動物中心提供，符合動物倫理要求。

1.2 試劑及儀器 芪參益氣滴丸（天津天士力制藥集團股份有限公司生產）、生理鹽水、CCK8（日本同仁）、DMEM 培養基（Gibco 公司）、胎牛血清（FBS 蘭州百靈優級血清）、倒置相差顯微鏡、二氧化碳恒溫培養箱（IL-161HI）、酶標儀（flexstation3）、離心機（LD5-2A）。

1.3 大鼠血管平滑肌細胞（VSMC）體外培養 SD 大鼠提取原代細胞：3%的水合氯醛腹腔麻醉，打開胸腔，用眼科剪及眼科鑷迅速分離出胸主動脈，放入無菌加入1%雙抗的PBS 中。采用高糖DMEM 培養基培養，其中含有20%的FBS，1%雙抗，細胞在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，1 周后觀察細胞生長情況；若貼壁良好，觀察到細胞已經從組織塊爬出，可更換細胞培養液，待細胞生長至80%～90%融合時，進行首次傳代[4]；每3 天傳代1 次，傳至第3 代更換為含10%胎牛血清DMEM 培養基培養，并經血管平滑肌肌動蛋白（α-actin）免疫組織化學鑒定[5，6]。倒置顯微鏡直接觀察細胞形態并拍照。

1.4 芪參益氣滴丸含藥血清制備 首先將大鼠進行標號，應用隨機數字表法進行分組，分為含藥血清組6 只，正常血清組5 只，含藥血清組給予大鼠芪參益氣滴丸，按0.135 g/（kg·d）灌胃（按照鼠與人體的每千克體重劑量折算系數6.25 計算）[7]，每只大鼠2 ml/（次·d）灌胃，正常血清組灌服等體積生理鹽水，連續灌胃5 d，末次給藥2 次，中間間隔1 h。最后給藥后1 h，10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔麻醉、固定、消毒[8]，無菌手術剪打開腹腔，分離腹主動脈。使用0.2 mm 血樣采集針迎血流方向插入腹主動脈，將血接入不抗凝管中。室溫下靜置3～4 h，3000 r/min，離心15 min，無菌分離血清，同組血清混合，用0.22 μm微孔濾膜過濾，置于無菌離心管中，-20 ℃保存備用，使用之前經56 ℃水浴滅活30 min[9]。

1.5 CCK8 測定芪參益氣滴丸含藥血清對VSMC 增殖的影響

1.5.1 芪參益氣滴丸含藥血清對VSMC 影響 取3～8代對數生長期細胞，按照3000 個/孔密度種板。分為1%雙抗的DMEM 培養液同步化組和非同步化組，每組分別再分為5%正常血清組、10%正常血清組、20%正常血清組、5%含藥血清組、10%含藥血清組、20%含藥血清組，每組4 個復孔。細胞于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下分別培養為24 h 后，加入預混均勻的100 μl 新鮮無血清培養基和10 μl 的CCK8溶液，將培養板在培養箱內孵育2 h，450 nm 處酶標儀檢測其吸光度（OD 值）[10]。

1.5.2 芪參益氣滴丸對VSMC 增殖的影響 取3～8代對數生長期細胞，按照3000 個/孔密度種板。用含有1%的FBS，1%雙抗的DMEM 培養液同步化24 h，設定5 個濃度，即正常血清組：1%正常血清組、3%正常血清組、5%正常血清組、10%正常血清組、20%正常血清組。含藥血清組：1%含藥血清組、3%含藥血清組、5%含藥血清組、10%含藥血清組、20%含藥血清組，每組4 個復孔。細胞于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件培養，分別在血清作用6、12、24、48、72 h取樣，用酶標儀在450 nm 波長處測定各組細胞的吸光度。檢測時，用移液器吸棄待測孔培養基，并加入預混均勻的100 μl 新鮮無血清培養基和10 μl的CCK8 溶液，將培養板在培養箱內孵育2 h，450 nm處酶標儀檢測其吸光度[10]。

1.6 統計學方法 數據采用SPSS 19.0 統計軟件進行分析，對所測結果進行正態性及方差齊檢驗，所有符合正態分布的計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差齊用LSD 檢驗，方差不齊采用Dunnett’T3 檢驗，P≤0.05 認為差異有統計學意義，P＜0.01 表示統計學意義顯著，P＜0.001 表示統計學意義極顯著。

2 結果

2.1 細胞鑒定結果 細胞培養2 周后呈放射性生長，細胞已經融合，部分地區高低起伏呈“峰-谷”生長，細胞形態多樣，可見細胞呈梭形、多角形、不規則形等（圖1A），符合平滑肌細胞峰-谷生長特點；經高內涵檢測細胞形態多為梭形和菱形，符合VSMC 形態。同時細胞漿中α-actin 蛋白高度表達，呈陽性，顯示所得細胞為純度較高的VSMC（圖1B）。

圖1 細胞鑒定結果

2.2 同步化組與非同步化組對平滑肌細胞增殖影響同步化組與未經同步化組比較，同步化組細胞增殖穩定，誤差較小；經24 h 含藥血清作用，5%含藥血清、10%含藥血清、20%含藥血清均能抑制平滑肌細胞增殖，且10%含藥血清抑制更明顯，20%含藥血清抑制相對較差，見表1、圖2。

圖2 兩組不同濃度含藥血清對細胞增殖作用比較

表1 同步化與未同步化組含藥血清OD 值比較（）

表1 同步化與未同步化組含藥血清OD 值比較（）

注：Z 表示正常血清組，Q 表示含藥血清組；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

2.3 不同濃度梯度及作用時間對VSMC 抑制作用1%含藥血清組與1%正常血清組不同時間點OD 值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；作用于VSMC 6、12 h 后，不同濃度含藥血清組與正常血清組OD 值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；作用于VSMC 24 h后，5%含藥血清組OD 值低于與5%正常血清組（P＜0.01），10%含藥血清組OD 值低于10%正常血清組（P＜0.001）；作用于VSMC 48 h 后，10%、20%含藥血清組OD 值低于正常血清組（P＜0.05）；5%含藥血清OD 值低于5%正常血清組（P＜0.001）；72 h 后不同濃度梯度均出現較其他時間點下降趨勢，3%、10%含藥血清組OD 值分別低于同濃度正常血清組（P＜0.05），5%含藥血清OD 值低于5%正常血清組（P＜0.001），見表2、圖3。

圖3 不同濃度含藥血清在不同時間對細胞增殖作用曲線

表2 不同濃度含藥血清在不同時間OD 值比較（）

表2 不同濃度含藥血清在不同時間OD 值比較（）

注：Z 表示正常血清組，Q 表示含藥血清組；24 h，5%Q 與5%Z 比較，P＜0.01，10%Q 與10%Z 比較，P＜0.001；48h，10%Q 與10%Z 比較，20%Q與20%Z 比較，P＜0.05，5%Q 與5%Z 比較，P＜0.001；72 h，3%Q 與3%Z 比較、10%Q 與10%Z 比較，P＜0.05，5%Q 與5%Z 比較，P＜0.01

3 討論

中藥成分復雜多樣，藥物進入人體，經代謝后產生的新的化合物更是復雜多樣，且難以探究[11]。血清藥理學通過給動物灌胃藥物，取其血清作為藥物源進行藥理學觀察，并進行藥理實驗，比較接近藥物體內環境中產生藥理作用的真實過程，能夠很好的進行中藥藥效觀察與研究[12]。提取的含藥血清進行體外實驗，能夠防止中藥粗制劑理化性質干擾，同時能夠反映出中藥經胃腸道消化吸收后，經生物轉化，產生的藥理效應[13]。現隨著科學技術提高和新技術的應用，中藥的單體成分成功分離，導致中藥整體性被割裂[14]；傳統口服給藥形式，使中藥只有被消化道吸收進入體內，才能發揮中藥活性，一部分是中藥本身活性，一部分是中藥進入人體產生代謝產物發揮的活性[15]。本實驗通過灌胃芪參益氣滴丸提取動物血清，并將其作用同源動物的平滑肌細胞，通過對血管平滑肌的作用，觀察不同濃度的芪參益氣滴丸含藥血清對VSMC 的作用。

本研究結果顯示，經同步化后正常血清組及含藥血清組隨濃度升高，細胞增殖及藥效作用較未同步化穩定；經同步化更有利于結果可靠性；同步化的對照組與含藥血清組比較，含藥血清抑制能夠對平滑肌細胞增殖，但不隨濃度增加而增強；24 h 后10%含藥血清組較10%正常血清組藥效作用最強，48 h 后5%含藥血清較5%正常血清組藥效作用最強，說明在進行含藥血清對平滑肌增殖實驗時，并不是含藥血清濃度越高，藥效作用越大；芪參益氣滴丸含藥血清抑制血管平滑肌作用較短時間與正常血清組無明顯差異，低濃度作用時間越長，藥效作用越明顯；高濃度同樣短時間與正常血清組無差異，而作用時間越長，其藥效的抑制作用并不會增強，考慮可能與除藥物經代謝后的產生的化合物外，血清本身含有的生長因子有關。目前研究制備含藥血清給藥方法多樣化，為使藥物能夠達到穩態需要濃度，現在主要采用每天灌胃1 次，連續給藥7～10 d[8]及連續3次給藥法[16]，最后1 次灌胃后間隔1～2 h 取血的方法。本實驗采用連續給藥5 d，最后1 d 為保證藥物濃度穩態加強給藥，能夠達到實驗要求，提取后經體外實驗藥效作用驗證，芪參益氣含藥血清能夠抑制血管平滑肌增殖，并與含藥血清濃度及作用時間密切相關，與既往研究一致[17]。

綜上所述，在血清藥理研究中，對于含藥血清的提取必須經過合理的灌胃方法，以保證其含藥物質的有效性，并通過細胞實驗來明確其作用效果。在血清藥理學研究中，含藥血清中本身含有細胞增值所需要的營養物質，對于研究藥物抑制增值相關實驗時須經過細胞同步化過程，以更加準確的判斷含藥血清對細胞增殖的抑制作用。同時，含藥血清抑制作用并不依賴含藥血清的濃度，并非濃度越高抑制作用越強，其主要原因是由于增加含藥血清濃度的同時增加血清中營養物質導致，故在研究含藥血清抑制相關細胞增勢的細胞實驗時，須探索出最佳作用濃度，以確保含藥血清抑制作用最強。因此，在血清藥理學實驗中，含藥血清提取、同步化過程、含藥血清濃度均是決定細胞實驗成功與否的條件。