梔子苷通過Nrf2/Keap1/ARE通路減輕重癥胰腺炎大鼠的肝損傷

王 丹，劉 捷，張細元，劉 萍，彭罕鳴

（華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院/武漢市婦幼保健院消化內科，武漢 430015）

研究[1]顯示，黃褐毛忍冬提取物中包括梔子苷在內的24種可能被吸收的化學成分可作用于319個急性肝損傷靶點，可能具有保肝的作用。核因子E2相關因 子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Kelch-like epichlorohydrinrelated protein-1，Keap1）/抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）通路在維持氧化還原平衡方面發揮重要作用，是氧化應激相關疾病防治的重要靶點[2]。本研究將探討梔子苷對SAP大鼠肝損傷的影響，并初步探討Nrf2/Keap1/ARE通路在其中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD雄性大鼠，6～7周齡，體質量200～260 g，購自杭州子源實驗動物科技有限公司，動物許可證編號：SCXK（浙）2019-0004。飼養環境：12 h光照/12 h黑暗，溫度20～25℃，濕度50%～60%，自由進水進食。適應性喂養1周。

1.1.2 主要試劑 梔子苷（貨號：D1773，HPLC≥98%）購自上海寶曼生物科技有限公司；牛磺膽酸鈉（貨號：B20918-20 mg，HPLC≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色試劑盒（貨號：RS3390-3）購自金克隆（北京）生物技術有限公司；大鼠超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonydialdehyed，MDA）、內毒素、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）酶聯免疫（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號：SBJ-R0008、SBJ-R0007、SBJ-R0392、SBJ R0546、SBJ-R0040）購自南京森貝伽生物科技有限公司；丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）ELISA試劑盒（貨號：GD-E005277866、GD-E0182-76993）購自上海冠導生物工程有限公司；兔抗Nrf2、兔抗Keap1、兔抗血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、兔抗GAPDH、山羊抗兔二抗（貨號：ab62352、ab627828、ab189491、ab128915、ab6721）購自美國abcam。

1.1.3 主要儀器 BX43型顯微鏡購自日本Olympus公司；Stat-Fax 2100型酶標儀購自美國Awareness公司；GelDocEZ型凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組、造模及給藥 用隨機數字表法將大鼠隨機分為5組：假手術組、SAP組和梔子苷低、中、高劑量組，每組10只大鼠。大鼠術前均禁食12 h，自由飲水，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg·kg-1）麻醉。將大鼠平臥捆綁于鼠板臺，腹部備皮、剖腹，向膽胰管內以0.2 mL·min-1勻速逆行注入5%牛磺膽酸鈉（1.5 mL·kg-1）制備SAP模型[3]，縫合腹部切口。假手術組大鼠開腹后輕微翻動胰腺組織數次，并向膽胰管內注入等量的生理鹽水后關腹。所有大鼠手術清醒后自由取水，單籠飼養。造模后2 h，梔子苷低、中、高劑量組大鼠分別給予12.5 mg·kg-1、25.0 mg·kg-1、50.0 mg·kg-1梔子苷灌胃[4]，假手術組、SAP組大鼠均灌胃等量的生理鹽水。

1.2.2 標本采集 術后24 h，大鼠腹主動脈取血2～5 mL，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清保存于-20℃冰箱，用于肝功能指標、內毒素、氧化應激指標、炎癥指標檢測。將大鼠斷頭處死，解剖留取肝組織，用于HE染色及蛋白檢測。

1.2.3 肝組織HE染色 取左側肝組織，用4%中性福爾馬林固定，脫水、包埋后切成厚度為2 μm的切片，參照HE染色試劑盒說明書步驟進行HE染色，用光學顯微鏡觀察肝組織病理變化。

1.2.4 氧化應激指標、內毒素、肝功能指標、炎癥指標檢測 使用SOD、MDA、內毒素、ALT、AST、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒測定血清SOD、MDA、內毒素、ALT、AST、IL-1β、TNF-α水平，具體步驟按說明書進行操作，酶標儀測定吸光度（optical density，OD）值，根據標準曲線計算得出血清SOD、MDA、內毒素、ALT、AST、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.5 肝組織中Nrf2/Keap1/ARE通路相關蛋白檢測 取右側肝組織，用手術剪剪成小塊，用勻漿器充分研磨，加入預冷的RIPA裂解液冰浴提取總蛋白，BCA法測定提取總蛋白濃度。將蛋白樣品95℃水浴5 min使蛋白變性，取等量蛋白加入上樣緩沖液混勻，隨后在聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，將電泳分離的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶封粉閉1.5 h，加入一抗兔抗Nrf2（1:1 000）、兔抗Keap1（1:1 000）、兔抗HO-1（1:500）、兔抗GAPDH（1:2 000），4℃孵育過夜，用TBST洗滌3次，加入的山羊抗兔二抗（辣根過氧化物酶標記，1:2 000），室溫孵育1 h，用TBST清洗3次，加入顯色劑顯色，凝膠成像系統成像，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，根據內參GAPDH條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

數據用SPSS 24.0軟件進行分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較進行單因素方差分析，兩兩比較進行SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織病理變化

HE染色顯示，假手術組肝組織未見明顯病理損傷；SAP組肝組織中肝細胞體積腫大、形態不規則，空泡化嚴重，存在炎性細胞浸潤及肝壞死灶；與SAP組相比，梔子苷低、中、高劑量組肝組織病理損傷情況有不同程度地減輕（見圖1）。

圖1 HE染色觀察各組肝組織病理變化（×200）

2.2 各組血清SOD、MDA水平比較

見表1。

表1 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較（±s，n=10） nmol·mL-1

表1 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較（±s，n=10） nmol·mL-1

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與SAP組比較，△P＜0.05；與梔子苷低劑量組比較，▲P＜0.05；與梔子苷中劑量組比較，□P＜0.05

組別 SOD MDA假手術組 4.28±0.46 1.12±0.14 SAP 組 0.97±0.10# 3.35±0.36#梔子苷低劑量組 2.04±0.19#△ 2.84±0.23#△梔子苷中劑量組 2.59±0.24#△▲ 2.45±0.21#△▲梔子苷高劑量組 3.14±0.25#△▲□ 2.02±0.20#△▲□

2.3 各組血清內毒素水平比較

見表2。

表2 各組血清內毒素水平比較（±s，n=10）EU·mL-1

表2 各組血清內毒素水平比較（±s，n=10）EU·mL-1

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與SAP組比較，△P＜0.05；與梔子苷低劑量組比較，▲P＜0.05；與梔子苷中劑量組比較，□P＜0.05

組別 內毒素假手術組 0.08±0.02 SAP組 0.33±0.05#梔子苷低劑量組 0.26±0.04#△梔子苷中劑量組 0.21±0.04#△▲梔子苷高劑量組 0.14±0.03#△▲□

2.4 各組血清ALT、AST水平比較

見表3。

表3 各組血清ALT、AST水平比較（±s，n=10） U·L-1

表3 各組血清ALT、AST水平比較（±s，n=10） U·L-1

組別 ALT AST假手術組 42.45±6.36 107.90±10.05 SAP組 385.38±40.74# 523.42±52.17#梔子苷低劑量組 265.42±32.25#△ 378.29±36.72#△梔子苷中劑量組 221.06±27.84#△▲ 314.26±33.25#△▲梔子苷高劑量組 176.47±25.03#△▲□ 259.68±30.68#△▲□

2.5 各組血清IL-1β、TNF-α 水平比較

見表4。

表4 各組血清IL-1β、TNF-α 水平比較（±s，n=10） ng·L-1

表4 各組血清IL-1β、TNF-α 水平比較（±s，n=10） ng·L-1

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與SAP組比較，△P＜0.05；與梔子苷低劑量組比較，▲P＜0.05；與梔子苷中劑量組比較，□P＜0.05

組別 IL-1β TNF-α假手術組 30.32±3.53 38.45±4.62 SAP 組 285.37±20.46# 312.41±25.84#梔子苷低劑量組 226.01±16.48#△ 258.78±22.73#△梔子苷中劑量組 188.85±15.72#△▲ 216.64±20.16#△▲梔子苷高劑量組 143.23±15.24#△▲□ 177.80±20.53#△▲□

2.6 各組肝組織中Nrf2/Keap1/ARE通路相關蛋白表達水平比較

見圖2、表5。

圖2 各組肝組織中Nrf2/Keap1/ARE通路相關蛋白表達情況

表5 各組肝組織中Nrf2/Keap1/ARE通路相關蛋白表達水平比較（±s，n=10） GAPDH

表5 各組肝組織中Nrf2/Keap1/ARE通路相關蛋白表達水平比較（±s，n=10） GAPDH

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與SAP組比較，△P＜0.05；與梔子苷低劑量組比較，▲P＜0.05；與梔子苷中劑量組比較，□P＜0.05

組別 Nrf2 Keap1 HO-1假手術組 0.63±0.05 0.65±0.06 0.88±0.07 SAP 組 0.30±0.04# 0.34±0.03# 0.41±0.04#梔子苷低劑量組 0.38±0.04#△ 0.41±0.04#△ 0.50±0.05#△梔子苷中劑量組 0.45±0.05#△▲ 0.49±0.05#△▲ 0.62±0.05#△▲梔子苷高劑量組 0.54±0.05#△▲□ 0.55±0.06#△▲□ 0.74±0.06#△▲□

3 討論

肝臟是各種因子的主要靶器官及滅活場所，作為胰腺血液回流的第一站，在SAP發生后最容易受損[5]。研究顯示，SAP的特點是產生并釋放大量炎癥介質及活性氧等細胞因子，可激活肝巨噬細胞引起炎癥反應綜合征，導致肝損傷，降低肝功能，并進一步刺激肝臟釋放更多的炎癥介質進入體循環，對全身其他臟器產生損傷[6]。本研究通過逆行膽胰管注射牛黃膽酸鈉制備SAP模型，結果顯示，SAP組大鼠肝組織中肝細胞體積、形態出現明顯變化，有炎性細胞浸潤、肝細胞壞死現象出現，同時血清ALT、AST水平顯著升高，提示SAP大鼠已出現肝損傷，且肝功能明顯下降。此外，SAP組大鼠血清SOD水平顯著降低，MDA、內毒素、IL-1β、TNF-α水平顯著升高，提示SAP大鼠體內氧化應激及抗氧化應激反應失衡，存在一定炎癥反應，同時肝組織功能的下降導致內毒素未被有效清除，已有大量內毒素進入體循環。

炎癥反應、氧化應激反應是加重SAP并發臟器損傷的主要因素，以炎癥反應、氧化應激反應為治療靶點展開治療已成為減輕SAP并發臟器損傷的重要方向。Li等[7]研究顯示，使用AG490抑制JAK2通路可減輕SAP相關的肝損傷，該機制可能與抑制TNF-α、IL-6和IL-18等促炎因子活性有關。Zhang等[8]研究顯示，在SAP早期誘導HO-1可能通過抑制TNF-α、促進IL-10來調節全身炎癥反應，并預防胰腺及肝損傷。Xu等[9]研究表明，大劑量的維生素C可通過Nrf2/NQO1/HO-1途徑抑制氧化應激，從而減輕SAP的胰腺損傷。梔子苷主要提取自茜草科植物梔子的果實，現代醫學證實梔子苷具有抗氧化、抗炎等藥理作用。鄧怒驕等[10]研究發現，梔子苷可以減輕炎癥反應，從而減輕酵母多糖引起的大鼠腸黏膜屏障損傷。馬金安等[11]研究顯示，梔子苷可以通過激活PI3K/Akt通路，抑制心肌缺血再灌注后的氧化應激反應及細胞凋亡，從而發揮保護作用。本研究顯示，低、中、高劑量的梔子苷均能減輕SAP大鼠的肝組織病理損傷，降低大鼠血清ALT、AST、內毒素水平，并呈劑量依賴性，提示梔子苷可減輕SAP大鼠肝損傷，提高肝功能，使SAP大鼠體內內毒素被肝組織有效清除。此外，低、中、高劑量的梔子苷均能顯著提高SAP大鼠血清SOD水平，降低血清MDA、IL-1β、TNF-α水平，提示梔子苷在SAP大鼠體內可發揮抗氧化應激和抗炎的作用。

轉錄因子Nrf2在生理條件下被負調控因子Keap1結合，處于滅活狀態，受到刺激后被Keap1釋放而激活，Nrf2活化后通過結合ARE轉化到細胞核，啟動下游靶基因如HO-1的轉錄，調節抗氧化應激反應。凌林等[12]研究發現，芍藥苷能改善膿毒癥引起的急性肺損傷，其機制與激活Nrf2/Keap1信號通路，降低組織氧化應激、炎癥水平有關。楊永康等[13]研究顯示，丹參提取物保護SAP肺損傷大鼠的肺組織，其機制與激活Nrf2/ARE信號通路，降低氧化應激反應有關。本研究顯示，低、中、高劑量的梔子苷均能提高SAP大鼠肝組織中Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表達水平，提示梔子苷可能通過激活Nrf2/Keap1/ARE通路，降低SAP大鼠體內氧化應激、炎癥水平，進而減輕SAP大鼠肝組織損傷并提高肝功能，有效清除體內的內毒素。

綜上所述，梔子苷通過激活Nrf2/Keap1/ARE通路，抑制氧化應激及炎癥反應，對SAP大鼠的肝組織發揮保護作用，但后續還需進一步驗證并完善梔子苷保護SAP大鼠肝組織的相關通路，為梔子苷治療SAP提供更全面的機制。