利用診斷超聲增強腫瘤放化療和免疫治療療效的研究進展*

劉政 屠娟 黃蕾丹 董小小 李濘珊

放化療是臨床大多數惡性腫瘤的首選和主要治療方法，而免疫治療則是當今最具發展前景的新興治療方法。然而，在這些治療中腫瘤常產生治療抵抗，嚴重影響了治療療效[1-3]。近年來，低強度超聲治療作為一種新的腫瘤治療抵抗的解決方法，正在受到業界的關注。

雖然超聲影像診斷在臨床廣泛應用，但超聲的治療作用一直是超聲醫學領域研究的重要方向[1]。低強度超聲一般指平均聲強（ISPTA）低于3 W/cm2的聚焦式或非聚焦式治療超聲，采用單晶片或多晶片相控陣超聲換能器。單晶片換能器聚焦范圍小而固定，一般4 mm×2 mm，焦點聲壓高；多晶片相控陣換能器聚焦范圍和形態可調，可變范圍大。與高強度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）的熱消融機制不同，低強度超聲治療機制主要以空化效應和機械效應為主，往往需要聯合使用超聲造影劑微泡（microbubble）來誘導增強空化效應，而熱效應則需要避免，故也稱為微泡介導的超聲空化治療方法[2，4]。

近年來，低強度超聲用于腫瘤放化療和免疫治療增強的基礎研究成果令人矚目，具有安全無創、療效顯著、簡便等特點，其治療機制也逐漸明朗[2，5]。其中，因具有低強度超聲輸出的相控陣超聲診斷儀廣泛應用于臨床，故直接采用超聲診斷儀實施超聲治療成為可能，并已被初步嘗試用于小樣本臨床研究[6]。

1 診斷超聲的治療機制

診斷超聲的治療原理與低強度超聲治療類似，但輸出能量和聲學參數更低,其平均聲強ISPTA<720 mW/cm2、機械指數（mechanical index，MI）<1.9、熱指數（thermal index，TI）<6.0，因此，診斷超聲在組織中產生的熱效應微小可忽略，其治療機制以超聲空化（cavitation）和機械效應為主。由于診斷超聲采用多晶片相控陣換能器，聚焦范圍及聚焦區聲壓可調（一般為0～3 MPa可調），并有實時影像監控的特點。

生物組織中通常含有很多的微小氣核（如溶解的氧氣），當超聲傳播且聲壓超過一定閥值時，這些氣核會發生空化諧振膨脹生成空化泡。在超聲作用下，空化泡會產生震蕩、膨脹、收縮以及內爆等一系列動力學過程，釋放出輻射壓力、沖擊波、微射流等機械能量，在微血管壁或細胞膜上形成微小聲孔（圖1），即所謂聲孔效應[7]（sonoporation），可能造成生物膜屏障通透性增高、甚至微小血管破壞和細胞凋亡等生物學效應。早期研究認為，在常用診斷超聲頻率范圍（1～5 MHz），生物組織自發空化所對應的聲壓閾值較高，空化強度微弱，隨機性強，不易控制，不適用于臨床治療。

近年來，一系列研究表明，造影劑微泡的應用賦予微泡精準調控聲場能量的能力，將微泡作為空化核注入體內可顯著降低空化閾值，高度聚集聲能，大幅度提高聲空化治療效應；在較低聲壓（<0.3 MPa）驅動下，微泡產生較溫和的穩態空化（stable cavitation），空化泡的周期性諧振會對附近細胞膜產生不斷的推拉作用或聲輻射壓力，或激發聲微流（microstreaming），進而在細胞膜上產生小于94納米的聲孔（圖1）；當驅動聲壓較大時（通常>0.3 MPa），主要引發造影劑微泡的非線性慣性空化（inertial cavitation，亦稱瞬態空化）行為。在此過程中，入射聲能會被高度集中，伴隨空化泡劇烈崩潰瞬間，在液體中的極小空間內釋放出沖擊波、微射流等機械能量，瞬間擊穿周圍的組織血管壁和細胞膜等生物屏障，慣性空化導致的細胞膜穿孔可能過大（2～4微米）而無法修復，進而引起細胞凋亡[7]。這些超聲空化效應所產生的生物學效應在腫瘤化療釋藥、放療增敏、基因轉染、開放血腦屏障和溶栓等眾多領域具有多種治療作用。

低強度超聲治療需要聯合靜脈注射超聲造影劑微泡，這種微泡平均粒徑為2～3 μm、微泡濃度為108～109/mL，其最佳諧振頻率為2～3 MHz，與低頻診斷超聲頻率符合。微泡在超聲治療中的作用不再是診斷作用，而是誘導空化效應的空化核治療作用。

2 超聲腫瘤血流效應

已知實體瘤的乏血供和乏氧狀態是造成腫瘤放化療和免疫治療抵抗的一個重要原因[3]，而診斷超聲治療具有刺激實體腫瘤血流灌注明顯增強的作用，即所謂“超聲腫瘤血流效應（sononeoperfusion）”，可能是解決乏血供腫瘤治療抵抗的一個新方法。

2.1 基礎實驗研究

前期實驗發現，采用參數改進的診斷超聲[參數設置：頻率3～4 MHz、機械指數MI 0.25～0.30，脈沖重復頻率（pulse repetition frequency，PRF）1kHz]聯合靜脈注射微泡治療大鼠Walker-256腫瘤和兔VX2腫瘤10～20 min后，結果顯示約80%的動物腫瘤血流灌注明顯增強，灌注面積增大，對于乏血供腫瘤的效果尤為明顯，部分缺血無灌注區重新獲得血流灌注，可持續4 h以上[8-9]。研究還發現，從超聲造影定量分析結果看，腫瘤血流量平均增加18%、平均血流灌注面積增加31%以上。腫瘤血流增強的機制，可能是因為微泡空化對微血管壁的機械刺激損傷，產生了炎癥反應和多種炎性擴血管因子釋放（圖2），治療后腫瘤組織的eNOs增加53.16%、NO增加28.80%、PGF2增加52.03%等。

2.2 臨床研究

由于超聲診斷儀和超聲造影劑微泡均是臨床常用的商品化醫療儀器和藥品，因此，在倫理批準的情況下，進行了小樣本乳腺癌[10]、胰腺癌和轉移性肝癌[11]的超聲化療臨床研究，治療參數為：發射頻率4 MHz，聲壓為0.3～0.6 MPa（對應MI值0.15～0.30），PRF 20 Hz，脈沖寬度18個周期，超聲聚焦區大小為2.5～4.0 cm；治療中勻速靜脈注射（推注速率0.5 mL/min）SonoVue微泡一支。結果顯示，超聲治療后乏血供腫瘤的血流灌注明顯增強，具體表現為超聲造影顯示的腫瘤灌注面積增大、血流灌注強度增強（圖3）。

3 超聲化療

3.1 基礎實驗研究

超聲化療（sonochemotherapy）的基礎研究眾多，涉及面廣泛，包括超聲化療釋藥機制、熱效應、機械效應、細胞內釋藥以及聯合實施方法等[2]。盡管這些研究采用的仍然是低強度超聲治療儀，但其平均聲強為22.57～2560 mW/cm2，聲壓在400 kPa～1.9 MPa，大部分參數均與診斷超聲能量范圍重疊，為利用診斷超聲聯合微泡實施低強度超聲治療提示了可能性。

超聲增強腫瘤化療的效果主要表現在以下方面[2]：增加腫瘤的化療釋藥1.5～10倍不等；超聲化療產生的腫瘤生長抑制效應可以造成腫瘤體積下降2倍，其生存期一般顯著高于單純化療。雖然診斷超聲比一般治療超聲的聲強更低，但仍然獲得了較好結果，如診斷超聲聯合微泡不僅可在化療時增強腫瘤血流灌注、提高腫瘤血管通透性，而且可增加至少兩種動物腫瘤的局部化療釋藥濃度，從而加強化療對腫瘤的生長抑制和殺傷作用[8-9]。該研究中，診斷超聲增強的化療在MI僅0.25的情況下，顯著提高了阿霉素對大鼠Walker-256腫瘤的局部釋藥3.12倍，且在組織分布更均勻；在兔VX2腫瘤模型中，也提高了阿霉素在腫瘤組織中的藥物濃度2.63倍，并且顯著抑制了腫瘤生長。上述結果充分說明，診斷超聲可能具有與一般低強度治療超聲同樣的治療效應。

3.2 臨床研究

近年診斷超聲已經開始被嘗試用于增強臨床胰腺癌化療，初步結果令人矚目。Dimcevski等[6]研究采用診斷超聲聯合微泡用于失去手術機會的胰腺癌的吉西他濱單藥化療，為單中心、小樣本回顧對照研究，其超聲治療參數頻率為1.9 MHz，MI為0.2（聲壓0.27 MPa），脈沖寬度4個周期；治療時推注SonoVue微泡0.5 mL/3.5 min，治療時間共31.5 min；結果超聲化療顯著延長10例胰腺癌患者的中位生存期（超聲化療組17.6個月，單純化療組8.9個月），超聲化療的周期數（13.8 ± 5.6）也比單純化療組（8.3 ± 6.0）明顯提高，其中2例患者在超聲化療結束后重新獲得了手術機會。本課題組也在國內完成了一項胰腺癌超聲化療隨機對照臨床研究（RCT）的入組和治療，試驗組采用經改進的診斷超聲（參數：MI 0.2、脈沖寬度8.5個周期、PRF 2 kHz，治療時推注SonoVue微泡1 mL/5 min，治療時間共25 min）聯合胰腺癌經典方案化療（吉西他濱+白蛋白紫杉醇），對照組僅實施經典化療，結果在試驗還未達到終點的情況下，試驗組的疾病控制率（DCR）顯著優于對照組（69.2% vs. 40%），且試驗組能耐受的化療周期數高于對照組6.0個周期，以上臨床研究中，均未發現超聲化療有增加化療不良反應的風險。

4 超聲放療

4.1 基礎實驗研究

所謂超聲放療主要是通過超聲刺激增加腫瘤血管內皮細胞對放療的敏感性、促進細胞凋亡，達到增強低劑量放療的目的[12-13]，產生該現象的主要機制是血管內微泡空化諧振的機械性刺激（如剪切力、微射流等），促進了內皮細胞合成神經酰胺（ceramide）。雖然內皮合成神經酰胺并不能直接克服腫瘤乏氧的放療抵抗，但通過一種酸性神經磷脂酶（sphingomyelinase）誘導的神經酰胺依賴機制卻顯示出低于8 Gy的低劑量放療有效殺傷腫瘤血管。

有學者對2-羥酰基鞘氨醇1-β-半乳糖基轉移酶（UGT8）在調控超聲放療引起的細胞應激反應中的作用進行了研究。UGT8 的主要功能是通過轉移尿苷二磷酸（uridine diphosphate，UDP）半乳糖基而合成半乳糖神經酰胺——一種抗凋亡分子。在免疫缺陷鼠中的研究發現，超聲放療可顯著下調UGT8表達而達到放療增敏效果，研究結論認為，超聲對內皮細胞產生機械刺激，誘導神經酰胺進入細胞而促進細胞死亡，進而明確了神經酰胺和酸性鞘磷脂酶通過介導血管內皮損傷而實現放療增敏的作用[14]。

目前，超聲增敏放療的方法已經在乳腺癌、膀胱癌、肝癌等多種腫瘤的動物模型中得到驗證，展現出對2～8 Gy低劑量放療的顯著增敏效果，具有降低放療不良反應的潛在意義[14]。盡管大多數基礎研究中，超聲治療仍然采用聚焦式超聲治療儀，但是不論其聲壓（550～570 kPa）、脈沖寬度（16個周期）和PRF（3 kHz）均在低強度超聲范疇，與診斷超聲參數有重疊且非常接近。

4.2 臨床研究

正因為超聲放療具有低強度超聲治療和對低劑量放療增效的特點，最近有學者采用超聲診斷儀聯合微泡的方法實施臨床超聲放療研究。首次超聲放療的臨床研究應用于原發性肝癌患者（hepatocellular carcinoma，HCC）的釔-90微球放療栓塞（transarterial radioembolization，TARE）治療，研究采用臨床常規的超聲診斷儀和造影劑微泡，而超聲治療選用微泡擊破模式（flash）進行，其頻率為1.5 MHz，機械指數為1.13，PRF 100 Hz，脈沖寬度4個周期，聯合Optison微泡（0.18 mL/min），治療時間10 min，最后以mRECIST標準評價4～6個月后的療效。結果顯示，在針對28例HCC患者的隨機對照研究（randomized controlled trial，RCT）中，超聲放療（共3次超聲治療）組患者獲得了93%的客觀緩解率，而對照組僅有50%（P<0.05，圖4）[15]。通過肝功能等放療相關的生化和血液檢查，未發現超聲放療有增加不良反應的風險。

5 超聲免疫治療

近年來，超聲空化治療方法也在增強腫瘤免疫治療方面凸顯希望[16-17]。超聲空化治療技術，從理論上可作用于腫瘤免疫周期的多個環節[18]，從而增強免疫治療療效（圖5）。其作用環節包括：1）直接機械性殺傷腫瘤細胞致抗原暴露，從而激活抗原提呈細胞，基于該理論的聲壓通常>3 MPa[19]；2）損傷腫瘤細胞，引起損傷相關分子模式（DAMPs）的表達，從而促進樹突狀（DC）細胞成熟；3）介導效應性T細胞歸巢，如刺激趨化因子、細胞因子釋放，從而募集效應性T細胞到達腫瘤微環境；4）聲孔效應突破“血-腫瘤屏障”，包括改變血管狀態、機械性擾動細胞外基質[20]，從而有利于效應性T細胞浸潤。

雖然超聲治療的能量形式具有多樣性，既有以熱效應為主的HIFU、以高強度空化機械消融為主的組織毀損術（histotripsy），也有微泡介導的低強度超聲空化治療方法，而采用安全性更好的診斷超聲激勵微泡同樣也產生了顯著的治療作用。有研究[21]發現，診斷超聲聯合微泡治療產生的血流增強效應聯合抗PDL1具有明顯抗腫瘤療效。具體表現在：增加了腫瘤中CD8+T細胞浸潤數量，CFSE標記的活化CD8+T細胞數量為對照組的1.96倍（P<0.01）；增加了抗PDL1在腫瘤內的濃度；聯合治療有促進腫瘤血管正常化的趨勢；最后，超聲改善了腫瘤免疫治療微環境。因此，超聲血流增強效應可作為增效PD-L1抗體腫瘤免疫治療的有效方法，目前超聲腫瘤免疫治療尚未見相關臨床研究報道。

6 安全性研究

診斷超聲和造影劑在臨床應用分別有超過60年和20年的安全記錄，在超聲放化療臨床研究中也未發現有增加不良反應的風險[6，11]，但是，其增強腫瘤血流效應是否可能有促進腫瘤轉移的風險是一個值得關注的問題。Zhang等[8]在采用兔VX2腫瘤模型的研究中，未發現超聲化療（阿霉素）有增加肺、腦、肝、腎等主要轉移靶器官的腫瘤轉移風險，超聲化療與單純化療之間比較轉移評級差異無統計學意義（P>0.05）。其他類似研究也未發現診斷超聲有增加小鼠黑色素瘤肺轉移轉移或結直腸癌脾轉移的風險[21-22]。因此，診斷超聲用于增強腫瘤化療尚未發現有明顯的不良反應。

7 針對超聲治療的儀器改進

利用診斷超聲實施低強度超聲治療具有超聲影像引導的先天優勢，由于診斷和治療脈沖是同一組換能器發射，診療信號完全同軸共面，故精準性有保證。

然而，一般超聲診斷儀畢竟是為超聲診斷設計制造的，雖然也可以用于超聲治療，但是在聲學參數調控、聲束聚焦和治療可操作性方面都有不少困難和局限性。為了適應超聲治療，國外有研究將診斷儀的脈沖寬度增加到5～20 μs（8～30個周期），以提高對微泡空化諧振的效率，因為常規超聲的脈沖非常短，僅有1～2個周期[23]。該研究對超聲診斷儀的治療改進相對豐富而完整，不僅增加了多個治療參數調控設置（機械指數、脈沖寬度和脈沖重復頻率等），而且還具有相控電子“弱聚焦”（即自適應可變焦域技術）、專用治療操作界面和程序設置等，使之成為一臺同時兼有超聲空化治療能力的超聲診療一體機（圖6）。該儀器采用了診斷和治療脈沖相間發射的方式，信號互不干擾，又能夠在超聲影像引導下對病灶進行聚焦治療。超聲能量輸出控制在診斷超聲標準范圍，腫瘤血流增強還可以通過儀器的造影功能實時評價。因此，該儀器可能成為實施低強度超聲治療較好的臨床研究平臺。

利用診斷超聲增強腫瘤放化療和免疫治療是全新的領域，尚存在許多認識空白。不同腫瘤及部位的超聲治療參數可能不一樣，今后更多將聚焦于腫瘤個性化治療參數，針對不同腫瘤探索適宜的超聲治療參數組合。

綜上所述，診斷超聲增強腫瘤放化療和免疫治療不僅安全無創，至今尚未發現明顯不良反應，而且還具備臨床轉化迅速的特點，是一個值得關注的新方法。