磁共振靶向成像檢測大鼠纖維化心肌中肌腱蛋白X表達的實驗研究

陸文燁 宋夢星 吳芬 夏敏 馬占龍

(南京醫科大學第一附屬醫院放射科，江蘇 南京 210029)

心力衰竭是一個主要的公共衛生問題，全世界心力衰竭的患病率較高。盡管治療策略取得了重大進展，但心力衰竭的發病率和死亡率仍很高[1]。心肌纖維化的特征是心肌中細胞外基質蛋白的過多沉積，是幾乎所有形式心力衰竭的必要組成部分[2-3]。因此，檢測心肌纖維化的發生，對及早發現和治療心力衰竭起著重要作用[4-6]。心臟磁共振成像作為一種無創評估心肌纖維化的強大工具[7]，檢測磁共振T2加權成像(T2 weighted imaging，T2WI)低信號則反映心肌梗死后局部心肌組織的纖維化改變。肌腱蛋白是細胞外基質最大的基底膜糖蛋白家族，肌腱蛋白X(tenascin-X，TNX)是其中表達量最高且促進心肌纖維化的主要結構蛋白[8-9]，促進表皮細胞向間質細胞轉化，調節基底膜細胞之間的黏附性。TNX的高表達加快了表皮樣細胞向纖維化細胞的轉變，促進了心肌的纖維化，進而影響了心肌細胞的血液再灌注及心肌修復[8，10-12]。動態檢測心肌纖維化細胞中TNX的表達，對于準確地評估心肌纖維化的發生和發展，促進心血管疾病的防治水平，具有重要的臨床價值，是研究心肌纖維化變化的理想特異性靶點。

本研究通過合成anti-TNX-USPIO探針，利用7.0 T磁共振檢測TNX在大鼠心肌纖維化細胞中的表達，目的是評估探針靶向檢測TNX表達的可行性，探索TNX作為檢測靶點是否可行，促進心肌纖維化的在體評估和診治水平。

1 材料與方法

1.1 心肌纖維化大鼠模型建立

選取36只6周齡無特定病原雄性SD大鼠，體重(225±10)g(購于北京維通利華實驗動物技術有限公司)，分為空白對照組(n=12)、單純對照組(n=12)和實驗組(n=12)。單純對照組和實驗組均皮下注射異丙腎上腺素，每日劑量為5 mg/kg，連續注射7 d；空白對照組皮下注射同等劑量生理鹽水，連續注射7 d。大鼠均飼養于無特定病原屏障內，3只/籠，正常飲食飲水，環境溫度維持于20～22 ℃，相對濕度為55%～60%。

1.2 anti-TNX-USPIO探針合成及表征分析

選用乙酰丙酮鐵作為前驅反應物，溶劑選用二芐醚，選用500 mL三頸燒瓶，依次加入20 mmoL乙酰丙酮鐵、100 mL二芐醚和23 mL油酸，調節氮氣速率為 130 mL/min，在冷凝回流條件下進行升溫，以此合成10 nm級Fe3O4@OA納米顆粒。采用旋轉蒸發法，在Fe3O4@OA納米顆粒表面修飾DSPE-PEG2000-COOH，制得Fe3O4@OA@PEG納米顆粒水溶液。于4 mL三氯甲烷中加入150 mg DSPE-mPEG2000和50 mg DSPE-PEG2000-COOH，充分溶解后加入鐵含量為10 mg的Fe3O4@OA納米顆粒，用100 Hz超聲充分混合，膠乳去離子水后蒸發10 min獲得穩定的Fe3O4@OA@PEG納米顆粒水溶液。采用一步法偶聯抗體制備合成探針，取1 mg Fe3O4@OA@PEG(以Fe計)溶液，加入200 μL多克隆TNX抗體(購自南京凱默爾生物科技中心)，加入100 μL維持電解質溶液(0.01 M，pH=5.5)調節溶液pH至5，加入1.0 mg二氯乙烷進行交聯，置于搖床混勻吸附30 min(120 r/min)。反應結束后用磁分離柱純化游離抗體，純化后的anti-TNX-USPIO靶向探針再次懸浮于磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)中，4 ℃冰箱保存。

采用透射電子顯微鏡測定探針粒徑，動態光散射分析儀測定探針水和粒徑及Zeta電位。在7.0 T磁共振下用不同鐵濃度測定T2弛豫率。

1.3 磁共振圖像采集及分析

實驗組(n=12)注入anti-TNX-USPIO合成探針(劑量為10 mg Fe/kg)，空白對照組(n=12)和單純對照組(n=12)分別注入同等劑量單純超微超順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)，均采用尾靜脈注射。三組大鼠分別于打藥前及打藥10 h后行磁共振成像，比較前后心肌信號強度變化。

心臟磁共振采用7.0 T磁共振掃描儀(Bruker PharmaScans，Germany，南京醫科大學磁共振影像實驗室)，大鼠線圈，接心電呼吸門控，通過氣體麻藥量調節心率約300次/min，呼吸頻率維持約35次/min。主要參數：視角3 cm×3 cm，矩陣256×256，回波時間 3.5 ms，重復時間130 ms，掃描層厚1 mm，翻轉角30 °。

圖像掃描完成后，采用Image J軟件計算心肌細胞的磁共振成像信號強度，在T2WI序列上每個標本畫3個感興趣區，取其平均值。相對信號強度(relative signal intensity，rSI)定義為同層面心肌信號強度/肌肉信號強度。

1.4 病理學檢查

掃描完成后，采用10%水合氯醛過量麻醉處死大鼠(劑量5 mL/kg)，開胸取大鼠心臟標本，用生理鹽水及PBS反復沖洗，固定于4%多聚甲醛。常規浸蠟包埋進行冰凍切片，片厚4 μm。光學顯微鏡下觀察心臟組織結構變化。標本分別作蘇木精-伊紅染色、Masson染色和普魯士藍染色，蘇木精-伊紅染色觀察心肌細胞形態，Masson染色觀察心肌細胞纖維化情況，普魯士藍染色觀察心肌細胞內鐵顆粒沉積情況。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 anti-TNX-USPIO合成探針的表征分析

靶向TNX抗體的合成探針溶液呈棕色清澈液體，透射電子顯微鏡下顯示探針呈類球形，于PBS中穩定分布，未見明顯團聚物形成(圖1a)。單純USPIO的水合粒徑為(15.55±0.45)nm，合成探針的水合粒徑為(22.89±1.66)nm，二者比較有顯著性差異(P=0.002)，表明TNX抗體與USPIO納米顆粒成功連接。將不同時間點的探針水和動力尺寸分布繪制成圖(圖1c)，說明合成探針顆粒分散性較好，無明顯聚集，保證探針在儲存過程中不會發生明顯變化。合成前單純USPIO的Zeta電位為-(46.2±1.38)mV，合成后TNX 抗體探針的Zeta電位為-(22.27±3.61)mV，二者之間差異有統計學意義(P<0.001)，再次證明TNX抗體已成功連接USPIO納米顆粒。ELISA結果顯示TNX合成探針保持較高的生物活性，而單純USPIO幾乎無活性(圖1b)。磁共振檢測合成探針的T2弛豫效能為193.2 mM-1s-1(圖1d和圖1e)，表明合成探針具有良好的超順磁性。

注：圖a為合成探針在PBS中均勻分布，圖b為ELISA法檢測OD450值，圖c為不同時間點合成探針的水和動力尺寸分布圖，圖d和圖e為不同鐵濃度下檢測T2弛豫效能。

2.2 TNX探針靶向心肌纖維化大鼠心臟磁共振成像及信號分析

三組大鼠分別通過尾靜脈注入anti-TNX-USPIO(實驗組)及單純 USPIO(單純對照組和空白對照組)，應用7.0 T磁共振進行前后兩次活體成像掃描。探針注入前，空白對照組未見明顯心肌異常改變(圖2a)，實驗組及單純對照組均顯示為T2WI信號減低(圖2c和圖2e)，實驗組及單純對照組左心室壁厚度[(1.26±0.14)mm]與空白對照組左心室壁厚度[(2.73±0.23)mm]相比有統計學意義(P<0.001)，表明心室壁變薄。空白對照組rSI為2.33±0.59，與實驗組及單純對照組的rSI(1.25±0.11)比較有統計學意義(P<0.001)，表明實驗組與單純對照組心室壁纖維化改變，與既往研究相符，建模成功。

與注入前比較，注入anti-TNX-USPIO 及單純USPIO后10 h，實驗組可見心肌信號強度減低(圖2f)，實驗組打藥后rSI為1.06±0.12，與打藥前的rSI(1.21±0.11)比較有統計學意義(P<0.001)；單純對照組心肌信號強度未見明顯減低，打藥后rSI為1.30±0.15，與打藥前的rSI(1.29±0.11)比較無顯著差異性(P=0.783)；空白對照組心肌信號強度未見明顯減低(圖2b)，打藥后rSI為2.17±0.28，與打藥前的rSI(2.33±0.59)比較無顯著差異性(P=0.240)。結果顯示實驗組打藥前后心肌信號強度明顯減低，表明合成探針anti-TNX-USPIO對T2WI信號有明顯減低作用。

2.3 病理學檢查結果

Masson染色顯示單純對照組和實驗組心肌細胞間纖維組織大量增生(圖3A-b和圖3A-c)，表明心肌纖維化改變，已成功建立心肌纖維化模型。普魯士藍染色證實空白對照組心肌細胞內無明顯鐵顆粒沉積(圖3C-a)，單純對照組心肌細胞內少許鐵顆粒沉積(圖3C-b)，實驗組心肌細胞內見明顯鐵顆粒沉積(圖3C-c)，驗證了纖維化心肌細胞中TNX抗體探針的存在。

3 討論

心肌纖維化是纖維結締組織對心臟侵害的結果，是指心肌組織中膠原纖維過量沉積、各型膠原比例失調、膠原纖維排列紊亂以及最終導致心臟結構重構(包括心腔擴大、室壁變薄和心肌細胞肥大及凋亡)。在刺激的作用下，血液循環的增加以及心肌促纖維化生長因子和細胞因子水平的升高，均可引發纖維化反應。心肌纖維化形成機制較復雜，心肌纖維化發生在多種促纖維化因子起作用時，存在于心臟的多種細胞類型，促纖維化因子可作為心肌細胞喪失(即修復性纖維化)反應的一部分被激活，也可通過機械和非機械(如神經激素、炎癥或代謝)對心臟的應激(即反應性纖維化)被激活[13]。在效應期，這種促纖維化生長因子和細胞因子與它的受體結合，然后觸發信號通路和轉錄因子的激活，在這些激活刺激的響應下，成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，導致α-平滑肌肌動蛋白的高表達，從而調節細胞外基質的平衡。心肌纖維化的特征是過量的膠原纖維沉積。膠原纖維沉積可表現為微瘢痕或位于單個心肌細胞和心肌細胞束周圍或心肌內血管周圍的間質間隙內的大束膠原沉積[14]。使用心臟磁共振或CT測量心肌細胞外體積可檢測彌漫性心肌纖維化，心肌細胞外體積能反映膠原纖維沉積的數量。晚期增強心臟磁共振可提供高分辨率的心肌組織表征，識別局部心肌的纖維化瘢痕，間接成為評估纖維化病變的技術[15]。但這些技術難以實現對心肌纖維化的精準檢測與評估。

注：空白對照組(圖a和圖b)與單純對照組(圖c和圖d)注入單純 USPIO以及實驗組(圖e和圖f)注入anti-TNX-USPIO前后對比圖像，實驗組及單純對照組與空白對照組比較，左心室壁厚度變薄，心肌信號減低(紅色箭頭所示)；與注入前比較，實驗組心肌信號強度減低，肝實質信號減低(*所示)，空白對照組與單純對照組無明顯改變。

TNX是肌腱蛋白家族中表達量最高的蛋白，它不僅是一種結構蛋白，還可通過調節細胞黏附來顯示基質細胞蛋白的特性，其穩定性表達與細胞和組織的結構完整性密切相關，其高表達與血管壁纖維化及鈣化相關[7，16-17]。TNX也是信號通路的細胞外調節因子。事實上，TNX已被證明可調節轉化生長因子-β的生物利用度和調節上皮細胞的可塑性。TNX的組織分布與肌腱蛋白C的分布往往是相互的，TNX主要參與皮膚組織穩態：限制角化細胞或成纖維細胞的增殖和遷移，而肌腱蛋白C發揮相反的作用：促進細胞分裂和運動[17]。USPIO的靶向成像對炎癥作用很有效，因為它直接作用于巨噬細胞[18-20]。利用納米氧化鐵增強磁共振成像，可利用超短回波時間來提高磁共振信號的線性度；高分辨率成像可以結合使用，以提高炎癥量化的空間分辨率和敏感性。USPIO可定位炎癥細胞浸潤的區域[21-23]。磁共振靶向檢測USPIO標記的巨噬細胞的可行性已在小鼠心肌梗死研究中得到證實[24]。USPIO具有獨特的造影劑特性，可用于靶向心血管成像。USPIO定位于活躍的巨噬細胞浸潤區域，并在T2WI上顯示為低信號[25-26]。TNX的高表達加快了表皮樣細胞向纖維化細胞的轉變，促進了心肌的纖維化，進而影響了心肌細胞的血流再灌注及心肌修復。動態檢測心肌纖維化細胞中TNX的表達，對于準確地評估心肌纖維化的發生和發展，促進心血管疾病的防治，具有重要的臨床價值，是研究心肌纖維化的理想特異性靶點。

注：圖A為Masson染色(×400)，空白對照組未見明顯纖維化病變(圖A-a)，單純對照組及實驗組膠原纖維大量增生(圖A-b和圖A-c)。圖B為蘇木精-伊紅染色(×400)，空白對照組肌肉細胞形態完整，界限分明(圖B-a)；單純對照組及實驗組肌肉細胞漿呈現明顯嗜伊紅性，橫紋消失，組織中有廣泛的炎性細胞浸潤(圖B-b和圖B-c)。圖C為普魯士藍染色(×400)，空白對照組心肌細胞內未見明顯鐵顆粒沉積(圖C-a)，單純對照組心肌細胞內見少許鐵顆粒沉積(圖C-b細箭頭所示)，實驗組心肌細胞內見明顯鐵顆粒沉積(圖C-c細箭頭所示)。

本實驗在注入探針前后分別掃描，注入探針前，空白對照組未見明顯心肌異常，實驗組和單純對照組均顯示T2WI信號減低，心室壁變薄，空白對照組的rSI(2.33±0.59)與實驗組和單純對照組的rSI(1.25±0.11)比較有統計學意義(P<0.001)，表明實驗組與單純對照組心室壁纖維化改變，建模成功，符合既往研究結果。探針注入后，實驗組可見心肌信號強度減低，實驗組打藥后rSI為1.06±0.12，與打藥前的rSI(1.21±0.11)比較有統計學意義(P<0.001)；單純對照組及空白對照組心肌信號強度未見明顯減低。普魯士藍染色證實實驗組斑塊內可見明顯鐵顆粒沉積，單純對照組僅可見少許鐵顆粒沉積。大鼠體內磁共振成像結果及病理學實驗表明，anti-TNX-USPIO合成探針可作為特異性靶向TNX的分子成像載體，無創和在體檢測纖維化心肌內TNX蛋白的分布，可將TNX作為心肌纖維化治療的特異性靶點，為下一步評估及診療提供思路。

本次實驗存在一定局限性，選用10 nm級USPIO合成探針所需沉積時間得到縮短，但影響探針到達靶向部位的數量，普魯士藍染色圖像中顯示鐵顆粒沉積數量較少，下一步需改進探針合成，優化anti-TNX-USPIO探針靶向成像。

總之，纖維化心肌細胞中存在TNX的表達，anti-TNX-USPIO合成探針可實現大鼠心肌纖維化細胞中TNX內靶向成像的檢測目的，也提示TNX有望作為心肌纖維化治療的特異性靶點，為下一步臨床防治心肌纖維化的研究提供新思路。