7 種植物精油對2 種蘋果病害病原菌的抑菌活性*

張 坤，張鵬九，高 越，劉中芳，楊 靜，樊建斌，趙勁宇，范仁俊

（山西農業大學植物保護學院，山西省農業科學院植物保護研究所，農業有害生物綜合治理山西省重點實驗室，太原 030031）

目前蘋果樹病害的防治措施主要為化學防治，由于化學農藥的頻繁使用，導致了土壤化學農藥的高殘留、果樹上耐藥性菌株的出現等一系列生態環境問題，這些因素嚴重限制了化學農藥的使用和蘋果產業的發展[1-2]。

按發病部位來劃分，蘋果樹病害可分為果實病害、枝干病害、葉片病害，其中，由于目前果園大多采用套袋技術，果實病害大大減少[3]。蘋果枝干病害分為蘋果樹腐爛病、蘋果干腐病和蘋果輪紋病，其中蘋果樹腐爛病是蘋果樹的重要病害，病原菌為黑腐皮殼菌（Valsa mali），枝干被侵染后，引起樹勢衰弱甚至整株死亡，在發病初期，常使用甲基硫菌靈可濕性粉劑防治[4]。葉片病害，蘋果斑點落葉病以發病早、傳播快、侵染后快速造成葉片早落，嚴重影響樹勢和產量為特點，成為蘋果七大落葉病（蘋果斑點落葉病、蘋果黑斑病、蘋果炭疽葉枯病、蘋果銹病、蘋果灰斑病、蘋果輪斑病、蘋果圓斑病）中最為典型易發的病害[5]，病原菌為鏈格孢蘋果專化型菌（Alternaria alternataf.sp.mali），在發病早期常使用戊唑醇微乳劑噴霧殺菌[6-7]。

植物精油作為一種植物源物質，是存在于植物中不同部位的一類相對分子質量較小、可隨水蒸氣蒸餾出來而又與水不相混溶的油狀成分的總稱[8]，是植物的次生代謝產物[9]。植物精油在自然界中分布廣泛，化學成分繁多，主要有萜類化合物、酸性化合物（如苯甲酸）、醇類化合物（如香葉醇、薄荷醇）、醛類化合物（如檸檬醛、肉桂醛）、酮體以及酚類等，其中萜烯類、萜類和芳香酚類化合物在精油活性中起重要作用，而醛類的抗真菌活性最高[10-11]。截至目前，已有多篇文獻研究報道了陳皮精油、松樹油、薄荷精油、檸檬精油、桉葉油、青蒿精油、生姜精油具有一定的抗菌活性[12-20]，而關于這7 種精油對上述2 種病原菌的抑菌活性以及精油對化學殺菌劑的藥量和藥效的影響卻鮮有報道。因此，我們選取蘋果樹上具代表性的2 種病菌作為供試病原菌，研究上述已被證實具有抑菌性的7 種植物精油對其的抑菌活性，同時在室內條件下研究了7 種植物精油對甲基硫菌靈和戊唑醇用藥量和藥效的影響，旨在為開發綠色植物源抑菌劑奠定基礎，并為果樹病害防治中農藥減施增效提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藥劑

99%陳皮精油、99%松樹油、99%薄荷精油、99%檸檬精油、99%青蒿精油、99%生姜精油、99%桉葉油等7 種供試精油均購自江西雪松天然藥用油有限公司；無水乙醇、吐溫-80 為市售化學純；丙酮為市售分析純；95%甲基硫菌靈原藥，由陜西美邦農藥有限公司提供；97%戊唑醇原藥，購自山東華陽科技股份有限公司；超純水為本實驗室制備。

1.2 試驗菌株和微生物培養基

蘋果樹腐爛病主要致病菌黑腐皮殼屬病菌，蘋果斑點落葉病主要致病菌鏈格孢蘋果專化型菌，均由山西農業大學植物保護學院果蔬病害實驗室提供。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）固體培養基（青島高科技工業園海博生物技術有限公司）：馬鈴薯精粉6.00 g，葡萄糖20.00 g，瓊脂20.00 g，稱取本品46.00 g，加蒸餾水1 000 mL，115 ℃高壓滅菌20 min，備用。

1.3 試驗儀器設備

FA1604B 萬分之一電子分析天平（上海精密儀器儀表有限公司），KQ-300E 超聲波振蕩器（上海五相儀器儀表有限公司），LDZH-150KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海精密儀器儀表有限公司），ULUP-Ⅱ超濾除熱源型超純水器（西安優普儀器設備有限公司），ZHJH-C1112B 超凈工作臺（北京思博晟達科技有限公司），HWS-80 恒溫恒濕培養箱（上海森信實驗儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

（1）7 種供試精油的單劑抑菌活性[21]。將1 g樣品用少許丙酮溶解后，配制成100 mg/mL 溶液備用，溶解過程中加入少許吐溫-80，并在超聲波振蕩器上振蕩5 min。用PDA 培養基梯度稀釋母液，稀釋至10、20、50、100、200、500 mg/L，倒入滅菌后的無菌培養皿中，待培養基冷卻凝固后，迅速接入活化以后的待測菌種，每個處理設置3 個重復，空白對照為只加少許吐溫-80 的等量丙酮。上述操作均在無菌操作臺完成后，將培養皿用封口膜處理并置于25 ℃恒溫培養箱中培養5 d，采用十字交叉法測量菌落的直徑，根據菌絲生長速率法計算抑制率和抑制中濃度EC50。

（2）復配劑的抑菌活性。選擇單獨使用抑菌效果相對較好的精油單劑兩兩復配，通過預試驗篩選不同精油復配比例，最佳配比為1∶1，故選擇松樹油、薄荷精油、陳皮精油、檸檬精油按體積比1∶1 進行復配，復配精油濃度梯度為10、20、50、100、200、500 mg/L，空白對照為只加少許吐溫-80 的等量丙酮，按（1）步驟配制培養基，加入待測菌種培養，測量菌落的直徑，根據Wadley 法計算復配劑的增效系數（SR）[22]。

（3）殺菌劑的抑菌活性。稱取95%甲基硫菌靈、97%戊唑醇原藥，分別用丙酮溶解配制成有效成分含量為1 000 mg/L 溶液備用，將溶液進行梯度稀釋，根據一系列預試驗結果，最終稀釋液濃度梯度為0.25、0.50、1.25、2.50、5、10 mg/L，倒入滅菌后的無菌培養皿中。待培養基冷卻凝固后，在加入甲基硫菌靈的培養皿中迅速接入活化以后的黑腐皮殼屬病菌，在加入戊唑醇的培養皿中迅速接入活化以后的鏈格孢蘋果專化型病菌，空白對照均為等量丙酮，其他步驟同（1）。

（4）精油單劑和農藥混配后對農藥抑菌性的影響。選擇單獨使用抑菌效果好的精油單劑備用，稱取一定量原藥溶解于丙酮和精油中，甲基硫菌靈原藥和戊唑醇原藥的使用濃度梯度均為0.25、0.50、1.25、2.50、5、10 mg/L，精油濃度為各自的抑制中濃度（EC50），配制成抑菌劑-精油混合溶液，對照組為（3）試驗組，其他步驟同（3）。

（5）精油復配劑和農藥混配后對農藥抑菌性的影響。選擇精油復配劑中抑菌效果好的檸檬-薄荷精油復配劑、檸檬-松樹油復配劑、薄荷-松樹油復配劑，分別加入到對應的抑菌劑溶液中，對照組為（3）試驗組，其他步驟同（3）。

抑制率（%）＝［（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅初始直徑）］×100

增效系數（SR）＝X1/X2，X1＝［（PA＋PB）×100］/（PA/A＋PB/B）

式中，X1 是混劑的EC50理論值；X2 為混劑EC50實測值；PA 為混劑中A 的百分含量；PB 為混劑中B 的百分含量；A 為混劑中A 的EC50值；B 為混劑中B 的EC50值。

SR≥1.50 表示具有增效作用；0.50＜SR＜1.50為相加作用；SR≤0.50 表示具有拮抗作用。

1.5 數據處理

運用Excel 2010、SPSS 17.0 軟件對試驗數據進行統計分析處理。

2 結果與分析

2.1 7 種植物精油對黑腐皮殼菌和鏈格孢蘋果專化型菌的抑制作用

由表1 可知，不同單劑對2 種病原菌抑制效果存在差異。7 種單劑均對黑腐皮殼菌具有抑制作用，其中陳皮精油、松樹油、薄荷精油抑菌活性最好，EC50分別為123.37、157.12、193.13 mg/L；其次為檸檬精油和青蒿精油，EC50分別為219.31、294.97 mg/L；生姜精油和桉葉油的EC50分別為2 153.16、2 632.33 mg/L，其抑制黑腐皮殼菌的活性明顯弱。

表1 7 種植物精油對黑腐皮殼菌和鏈格孢蘋果專化型菌菌絲生長的抑制效果

7 種單劑中，對鏈格孢蘋果專化型菌的抑制效果最好的是陳皮精油，EC50為148.13 mg/L，松樹油和薄荷精油、檸檬精油次之，EC50在188～423 mg/L之間，青蒿精油、生姜精油、桉葉油未見抑制效果（表1）。

2.2 植物精油復配劑對黑腐皮殼菌和鏈格孢蘋果專化型菌的抑制作用

由圖1 可知，薄荷精油-松樹油復配劑對蘋果黑腐皮殼菌的抑制效果比二者單獨使用時強，增效系數（SR）為2.30，表現增效作用，EC50為75.04 mg/L；檸檬精油-薄荷精油復配劑的抑菌效果也表現為增效作用，SR 為2.11，EC50為96.74 mg/L；其他精油復配劑的抑菌活性均較相應的單劑低，SR＜0.50，具有拮抗作用，EC50在239.25～725.51 mg/L 之間。

圖1 精油復配劑對黑腐皮殼菌的抑制作用

由圖2 可知，檸檬精油-松樹油復配劑對鏈格孢蘋果專化型菌的抑制效果較二者單獨使用時要好，SR 為2.10，表現增效作用，EC50為122.02 mg/L；其他精油復配劑的抑菌效果均較相應的單劑差，SR＜0.50，表現為拮抗作用，EC50在122.02～589.66 mg/L 之間。

圖2 精油復配劑對鏈格孢蘋果專化型菌的抑制作用

2.3 不同植物精油單劑和復配劑對化學殺菌劑的減施增效作用

2.3.1 對甲基硫菌靈防治黑腐皮殼菌的減施增效作用

由圖3-A 可知，甲基硫菌靈＋松樹油對蘋果黑腐皮殼菌的EC50為1.43 mg/L，較甲基硫菌靈單獨使用時降低55.86%；甲基硫菌靈＋薄荷精油對蘋果黑腐皮殼菌的EC50為1.55 mg/L，降低52.16%；甲基硫菌靈+陳皮精油對黑腐皮殼菌的EC50為1.60 mg/L，降低50.62%；甲基硫菌靈＋檸檬精油對蘋果黑腐皮殼菌的EC50為2.35 mg/L，降低27.47%，甲基硫菌靈對黑腐皮殼菌的EC50為3.24 mg/L。

圖3 精油單劑和復配劑對甲基硫菌靈抑制黑腐皮殼菌的作用

由圖3-B 可知，薄荷精油和松樹油復配劑與甲基硫菌靈混配后，對黑腐皮殼菌的抑菌活性較甲基硫菌靈單劑高，EC50為1.03 mg/L，較甲基硫菌靈單獨使用時降低68.21%；檸檬精油和薄荷精油復配劑與甲基硫菌靈混配后，抑菌活性較甲基硫菌靈單劑要低，EC50為4.78 mg/L，較甲基硫菌靈單獨使用時增高47.53%。

2.3.2 對戊唑醇防治鏈格孢蘋果專化型菌的減施增效作用

由圖4-A 可知，戊唑醇＋陳皮精油對鏈格孢蘋果專化型菌的EC50為2.04 mg/L，較戊唑醇單獨使用降低56.32%；戊唑醇＋松樹油對鏈格孢蘋果專化型菌的EC50為2.79 mg/L，降低40.26%；戊唑醇＋薄荷精油對鏈格孢蘋果專化型菌的EC50為3.90 mg/L，降低16.49%；戊唑醇＋檸檬精油對鏈格孢蘋果專化型菌的EC50為4.33 mg/L，降低7.28%，戊唑醇對鏈格孢蘋果專化型菌菌絲生長的EC50為4.67 mg/L。

由圖4-B 可知，松樹油和檸檬精油復配劑與戊唑醇混配后，對鏈格孢蘋果專化型菌的EC50為1.93 mg/L，較戊唑醇單獨使用時降低58.68%。

圖4 精油單劑和復配劑對戊唑醇抑制鏈格孢蘋果專化型菌的作用

3 討論與結論

本文研究了在室內條件下7 種植物精油對黑腐皮殼菌和鏈格孢蘋果專化型菌的抑菌活性，同時研究了7 種精油對甲基硫菌靈防治蘋果黑腐皮殼菌、戊唑醇防治鏈格孢蘋果專化型菌的影響。結果表明，陳皮精油、松樹油、薄荷精油、檸檬精油4 種精油單劑對黑腐皮殼菌和鏈格孢蘋果專化型菌2 種病原菌均具有一定程度的抑制作用，青蒿精油僅明顯抑制黑腐皮殼菌菌絲生長，而桉葉油與生姜精油對2 種病原菌均無明顯的抑制效果。左春生等[23]發現桉葉油可明顯抑制鴨疫里默氏菌，其最小抑菌濃度為78.12 μL/L。這與本研究結果存在不同，其原因可能是鴨疫里默氏菌是一種黃桿菌種，屬于卵生類家禽細菌，而本研究中黑腐皮殼菌和鏈格孢蘋果專化型菌均為半知菌亞門真菌[24]。魯萌萌等[25]通過透射電鏡發現生姜精油能延長細菌的生長停滯期，抑制細菌的生長速率，且能引起細菌細胞膜破損，致使胞內物質滲漏，從而抑制細菌活性。因此，桉葉油和生姜精油對細菌具有抑菌作用，而對果樹病害真菌卻無明顯抑菌作用。而關于植物精油的抑菌機理，國內外也進行了相關研究，普遍認為精油中的抑菌成分抑制了病原菌菌絲生長以及孢子萌發，同時改變了細胞膜的滲透性和宿主抗病性，增加了細胞膜相對電導率，導致核酸、蛋白質和ATP 都發生丟失[26-27]。

本研究發現，與其單獨使用相比，薄荷精油-松樹油復配劑、薄荷精油-檸檬精油復配劑對黑腐皮殼菌的抑制作用增強，檸檬精油-松樹油復配劑對鏈格孢蘋果專化型菌的抑制作用增強。這與劉歡等[28]的研究結果相似，他們測試了精油有效成分肉桂醛/檸檬醛協同抑菌活性，發現精油復配以后使葡萄灰霉菌的細胞溶出物釋放量和細胞膜滲透性顯著增加，抑菌效果更強。

精油與甲基硫菌靈和戊唑醇2 種殺菌劑混配后，其中，陳皮精油、松樹油、薄荷精油、檸檬精油的單劑均增強了甲基硫菌靈對蘋果黑腐皮殼菌、戊唑醇對鏈格孢蘋果專化型菌的抑菌能力。但精油復配劑與殺菌劑混配后，僅薄荷精油-松樹油復配劑增強了甲基硫菌靈對蘋果黑腐皮殼菌的抑菌能力，檸檬精油-松樹油復配劑增強了戊唑醇對鏈格孢蘋果專化型菌的抑菌能力。結合農藥助劑的作用原理[29]，推測可能是精油增強了化學殺菌劑的滲透性和潤濕性，使殺菌劑成分更快、更有效地進入病原菌細胞內，加快影響了蘋果黑腐皮殼菌和鏈格孢蘋果專化型菌細胞膜的通透性，甚至破壞了其磷脂雙分子層；或者破壞了2 種菌的細胞膜，使內溶物和離子外流導致細胞死亡[30]；同時，也有可能精油與化學殺菌劑成分之間多點協同，破壞了2 種菌的胞內酶系統，阻礙了遺傳物質的復制傳遞和微生物的繁殖，最終結果是抑制了它們的生長甚至導致死亡[31]。綜上，陳皮精油、松樹油、薄荷精油、檸檬精油不僅可以抑制2 種病原菌的生物活性，還對甲基硫菌靈和戊唑醇的抑菌性產生增效作用，具有成為綠色植物源殺菌劑和化學農藥助劑的潛力。

本研究為植物精油在蘋果樹枝干、葉部病害的防治提供了新的思路，也為植物源殺菌劑和植物源農藥助劑的開發提供了基礎數據。但當下植物精油作為天然殺菌劑和農藥助劑成分的應用仍然面臨諸多問題，比如植物原材料提取精油效率不高[32]、提取后存放不恰當會見光分解造成浪費[33]、植物精油具有強烈揮發性[34]等，這些問題可以借鑒精油在食品行業中的應用原理從而得到解決，如優化精油的提取工藝、改良儀器設備，避免原材料浪費，提取后采用不透光密封罐儲存，田間施用時采用殼聚糖膜包裹制成殼聚糖精油復合膜，從而延遲精油的釋放[35-36]。

本試驗通過室內測定發現，與精油混配后，甲基硫菌靈的使用量減少27.47%～68.21%，戊唑醇的使用量減少7.28%～58.68%，如果能應用到生產中，會改善生態環境。但是有關精油對殺菌劑的增效機制還有待進一步研究，下一步將探明機制并將篩選出來的精油開發成植物源農藥助劑產品，應用到果園生產中。