番鴨細小病毒YL08株VP2和VP3蛋白的原核表達及免疫反應性

李靜 謝鵬宇 于天飛 柳芳芳 尹海暢 于志丹

摘要：為獲得番鴨細小病毒（muscovy duck parvovirus，MDPV）重組結構蛋白VP2、VP3，本研究以含有MDPV YL08株VP1基因的重組載體pET-32a-VP1為PCR擴增模板，分別亞克隆VP2、VP3基因。構建了重組載體 pGEX-6p-VP2、pGEX-6p-VP3并將它們轉化至大腸桿菌Rosetta（DE3）中，分別構建了重組菌株pGEX-6p-VP2/Rosetta（DE3）和pGEX-6p-VP3/Rosetta（DE3）。2種重組菌株在IPTG誘導下分別獲得了重組蛋白GST-VP2和GST-VP3，分子質量分別為91、86 ku。Western blot分析結果表明，重組蛋白GST-VP2和GST-VP3可特異性結合GST-tag單克隆抗體和MDPV感染番鴨血清，免疫反應性良好。Dot-ELISA比較分析結果表明，在等質量條件下，GST-VP2的免疫反應性強于GST-VP3。

關鍵詞：番鴨細小病毒;VP2;VP3;原核表達;免疫反應性

中圖分類號： S852.65+7? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）09-0169-04

番鴨細小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）主要侵害3周齡以內的雛番鴨，引起番鴨細小病毒病，國內亦稱番鴨“三周病”[1-2]。我國動物醫學專家林世棠于1991年最先發現并報道了該病發生[3]。番鴨細小病毒病發病率為40%～50%，死亡率在50%～80%之間，對番鴨飼養業的危害極大[4]。MDPV和親緣關系密切的鵝細小病毒（goose parvovirus，GPV）一同被列為細小病毒科（Parvoviridae）依賴病毒屬（Dependovirus）雁形目依賴細小病毒1（Anseriform dependoparvovirus 1）[5]。MDPV是1 種單鏈DNA病毒，無囊膜，基因組大小為5 132 nt，兩端為末端倒置重復序列（ITR）[6]。MDPV基因組有左、右2個開放閱讀框，以重疊基因的形式利用轉錄本可變剪接方式分別編碼轉譯非結構蛋白（NS）和結構蛋白（VP）。已有研究表明，NS參與病毒復制，調控病毒基因表達[7]。VP1、VP2和VP3等3 種結構蛋白以約1 ∶1 ∶8的比例組裝病毒衣殼[8]。已有研究表明，VP2為重要免疫原性蛋白[9]。本研究通過原核表達系統表達獲得MDPV YL08株VP2、VP3重組蛋白，以期為MDPV病毒相關蛋白功能研究奠定物質基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種和質粒

含有MDPV YL08株全長VP1基因的重組載體pET-32a-VP1[10]、原核表達載體pGEX-6p-1、感受態大腸桿菌DH5α和Rosetta（DE3）由齊齊哈爾大學生命科學與農林學院動物免疫學研究室制備或保存。

1.2 主要分子生物學試劑

T 4 DNA連接酶、BamHⅠ和XhoⅠ限制性核酸內切酶購自寶生物工程（大連）有限公司;質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自Omega公司。辣根過氧化物酶（HRP）標記的GST-tag單克隆抗體購自Thermo Fisher公司。HRP-兔抗鴨IgY IgG（H+L）購自上海銘修生物科技有限公司。

1.3 試驗時間與地點

試驗于2020年10月至2021年2月在齊齊哈爾大學生命科學與農林學院動物免疫學研究室進行。

1.4 引物設計

參照MDPV YL08株VP1基因序列（GenBank登錄號：KU589295），利用Primer Premier 5.0軟件設計了3條特異性引物，由哈爾濱博仕生物技術有限公司合成。

VP2F：5′-CGCGGATCCACGGCTCCTGCTAAAAAG-3′（劃線處為BamHⅠ位點）;

VP3F：5′-CGCGGATCCATGGCAGAGGGAGGAAG-3′（劃線處為BamHⅠ位點）;

VPR：5′-GGCCGCTCGAGTTACAGATTCTGAGTC-3′（劃線處為XhoⅠ位點）。

1.5 基因片段擴增及回收純化

VP2基因PCR反應體系（50 μL）：2 μL 1 ∶10 000稀釋的pET-32a-VP1，4 μL dNTPs，5 μL 10×PCR Buffer，1 μL 上游引物VP2F（25 pmol/μL），1 μL 下游引物VPR（25 pmol/μL），1 μL ExTaq酶（5 U/μL），36 μL 無菌去離子水。PCR擴增程序為：94.0 ℃ 5 min;94.0 ℃ 90 s，30.0 ℃ 90 s，72.0 ℃ 3 min，35 個循環;72.0 ℃ 7 min;4.0 ℃終止反應。

VP3基因PCR反應體系（50 μL）：2 μL 1 ∶10 000稀釋的pET-32a-VP1，4 μL d NTPs，5 μL 10×PCR Buffer，1 μL 上游引物VP3F（25 pmol/μL），1 μL 下游引物VPR（25 pmol/μL），1 μL ExTaq酶（5 U/μL），36 μL 無菌去離子水。PCR擴增程序為：94.0 ℃ 5 min;94.0 ℃ 90 s，57.0 ℃ 90 s，72.0 ℃ 3 min，35 個循環;72.0 ℃ 7 min，4.0 ℃終止反應。

上述2種PCR擴增產物分別通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。按照Omega公司DNA膠回收試劑盒說明書操作流程回收純化VP2、VP3基因PCR擴增片段。

1.6 重組載體pGEX-6p-VP2和pGEX-6p-VP3的構建

膠回收BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后的VP2、VP3基因PCR擴增片段和表達載體pGEX-6p-1。分別在含有VP2/pGEX-6p-1和VP3/pGEX-6p-1的連接體系中加入T 4 DNA連接酶，于16 ℃的溫度下連接過夜。連接產物VP2/pGEX-6p-1和VP3/pGEX-6p-1分別轉化DH5α。挑取單個轉化后的DH5α菌落于LB液體培養基（氨芐青霉素，100 μg/mL）中，37 ℃溫度下培養14 h，按照Omega公司質粒提取試劑盒說明書操作流程提取質粒。酶切鑒定并測序驗證外源基因插入的準確性。獲得的重組載體分別命名為pGEX-6p-VP2、pGEX-6p-VP3。B34FDA31-1A06-492A-ACC5-3C31F209EC5F

1.7 重組蛋白GST-VP2和GST-VP3的誘導表達

分別將pGEX-6p-VP2和pGEX-6p-VP3轉化感受態大腸桿菌Rosetta（DE3），制備重組菌pGEX-6p-VP2/Rosetta（DE3）、pGEX-6p-VP3/Rosetta（DE3）。按照1 ∶100的比例分別將pGEX-6p-VP2/Rosetta（DE3）、pGEX-6p-VP3/Rosetta（DE3）接種于50 mL LB液體培養基（氨芐青霉素，100 μg/mL）的中，220 r/min、37 ℃溫度下繼續培養至適宜的誘導表達濃度（D 600 nm=0.5～0.6）時，加入IPTG使其在整個誘導體系中的濃度為 1.0 mmol/L，37 ℃溫度下繼續培養4 h，間隔1 h取樣。各個時間段獲得的菌液樣品以8 000 g/min離心5 min，棄去上清液。以菌體沉淀濕質量計算，按照30 μL/mg的比例用PBS重懸菌體沉淀。通過SDS-PAGE方法檢測重組蛋白GST-VP2和 GST-VP3 表達情況。

1.8 重組蛋白GST-VP2和GST-VP3的純化及鑒定

按照文獻[11]所述方法分別純化重組蛋白 GST-VP2 和GST-VP3，Bradford法測定蛋白濃度[12]。純化的GST-VP2和GST-VP3轉印到硝酸纖維素膜上。將含有轉印蛋白的膜片置于5%脫脂乳溶液中，于4 ℃溫度下封閉過夜。37 ℃溫度下置于PBS（1 ∶100）稀釋的HRP標記抗GST-tag單克隆抗體溶液中孵育2 h，PBST溶液洗滌3 次后以4-CN作為酶促反應底物進行顯色。

1.9 重組蛋白GST-VP2、GST-VP3的免疫反應性

按照“1.8”節中的操作方法對重組蛋白GST-VP2和GST-VP3進行轉印和封閉。封閉后的含有轉印蛋白的硝酸纖維素膜在37 ℃溫度下依次置于PBS稀釋（1 ∶200）的MDPV陽性血清中作用2 h、PBS稀釋（1 ∶1 000）的HRP-兔抗鴨IgY IgG（H+L）中作用1 h，PBST溶液洗滌3 次后以4-CN作為酶促反應底物進行顯色。

1.10 Dot-ELISA比較重組蛋白GST-VP2和 GST-VP3的免疫反應性

將GST-VP2和GST-VP3分別以1 000、100、10、1 ng/點的包被量直接點于硝酸纖維素膜上，一抗使用PBS稀釋（1 ∶200）MDPV陽性血清，酶標二抗使用PBS稀釋（1 ∶1 000）的HRP-兔抗鴨IgY IgG（H+L），具體操作步驟參照文獻[13]進行。

2 結果與分析

2.1 MDPV YL08株VP2、VP3基因的PCR擴增

通過PCR擴增，分別亞克隆獲得了與預期大小符合的1 870 bp（VP2）和1 610 bp（VP3）的DNA片段，PCR的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1。

2.2 重組載體pGEX-6p-VP2、pGEX-6p-VP3的酶切鑒定

酶切鑒定結果表明，pGEX-6p-VP2經XhoⅠ酶切得到約6 800 bp的條帶（表達載體pGEX-6p-1和VP2基因片段大小之和），經BamHⅠ和XhoⅠ酶切得到約4 900 bp載體條帶和1 900 bp的VP2基因片段條帶;單酶切pGEX-6p-VP3得到約6 500 bp的條帶（表達載體pGEX-6p-1和VP3基因片段大小之和）、雙酶切pGEX-6p-VP3得到約4 900 bp的載體條帶和1 600 bp的VP3基因片段。由圖2可知，上述酶切產物瓊脂糖凝膠電泳結果與預期相符。測序結果表明，VP2、VP3基因已正確插入至原核表達載體pGEX-6p-1中。

2.3 重組蛋白GST-VP2、GST-VP3的表達

SDS-PAGE結果，由圖3可知，IPTG誘導后，pGEX-6p-VP2/Rosetta（DE3）和pGEX-6p-VP3/Rosetta（DE3）可分別表達出符合預期大小的91 ku和86 ku的目的蛋白條帶（白色箭頭所示）。

2.4 重組蛋白GST-VP2、GST-VP3的純化及鑒定

由GST-VP2和GST-VP3純化結果（圖4），Bradford法檢測GST-VP2和GST-VP3的濃度分別為0.77、0.63 mg/mL。GST-VP2和GST-VP3可與HRP標記抗GST-tag單克隆抗體特異性結合，說明獲得的2種蛋白為融合于GST標簽的重組蛋白。

2.5 重組蛋白GST-VP2、GST-VP3的免疫反應性

由Western blot結果（圖5）可知，GST不與MDPV感染番鴨血清結合，硝酸纖維素膜對應位置無代表陽性反應的深色條帶;重組蛋白GST-VP2、GST-VP3可與MDPV陽性血清特異性結合，硝酸纖維素膜對應位置上顯示出明顯深色條帶，免疫反應性良好。

2.6 Dot-ELISA比較重組蛋白GST-VP2和 GST-VP3的免疫反應性

重組蛋白GST-VP2和GST-VP3在抗原包被量為1 000、100、10 ng/點時，均可與MDPV陽性血清發生特異性的結合，形成清晰的陽性反應斑點;抗原包被量在1 ng/點時，GST-VP3幾乎無可見斑點，GST-VP2仍可見陽性反應斑點（圖6） ，表明重組蛋白GST-VP2的免疫反應性強于GST-VP3。

3 討論與結論

MDPV YL08株為2008年筆者所在實驗室分離鑒定的1株新型MPDV，重組分析表明其可能起源于不同的MDPV之間的重組[14]。這些新型重組毒株的出現，提示我們在臨床上應持續監測、探索番鴨細小病毒病的流行病學及臨床進化。Wang等通過原核系統表達獲得了MDPV VP1蛋白氨基端的含有198個氨基酸的重組蛋白，并以此重組蛋白作為檢測抗原通過Western blot檢測了臨床血清樣本，檢測結果表明，能與該重組蛋白特異性結合的抗體最早出現于番鴨感染MDPV之后的第6周[15]。據此認為，基于VP蛋白的診斷抗原可用于檢測MDPV晚期感染。通過桿狀病毒/昆蟲細胞表達的MDPV VP2和VP3蛋白亦具有良好的抗原性，可作為診斷抗原[16]。真核表達系統表達的蛋白相較于原核表達系統表達的蛋白具有更為完善的糖基化等修飾過程，但表達試驗操作步驟復雜、成本較高，如果原核表達的蛋白就能滿足免疫反應性等要求，采用原核表達系統表達目的蛋白更具有時間成本和經濟成本優勢。Dot-ELISA分析中，重組蛋白GST-VP2的免疫反應性強于GST-VP3，這可能是因為VP2蛋白比VP3蛋白的分子量更大，理論上含有更多的抗原表位。本研究獲得了原核表達的抗原性良好的MDPV 重組VP2、VP3蛋白，可為MDPV病毒蛋白功能研究奠定一定的物質基礎。B34FDA31-1A06-492A-ACC5-3C31F209EC5F

參考文獻：

[1]Shen H Q，Huang J F，Yan Z Q，et al. Isolation and characterization of a recombinant Muscovy duck parvovirus circulating in Muscovy ducks in South China[J]. Archives of Virology，2020，165（12）：2931-2936.

[2]吳 萌，朱善元，吳海濤，等. 番鴨細小病毒VP3基因在昆蟲細胞中的表達與鑒定[J]. 江蘇農業科學，2018，46（21）：58-60.

[3]林世棠，郁曉嵐，陳炳鈿，等. 一種新的雛番鴨病毒性傳染病的診斷[J]. 中國畜禽傳染病，1991，13（2）：25-26.

[4]袁佐清，吳慶海，曹 錚，等. 番鴨細小病毒病近年研究進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2020（15）：39-42.

[5]Wang J Y，Mi Q L，Wang Z X，et al. Sole recombinant Muscovy duck parvovirus infection in Muscovy ducklings can form characteristic intestinal embolism[J]. Veterinary Microbiology，2020，242：108590.

[6]Wang J Y，Wang Z X，Jia J Y，et al. Retrospective investigation and molecular characteristics of the recombinant Muscovy duck parvovirus circulating in Muscovy duck flocks in China[J]. Avian Pathology，2019，48（4）：343-351.

[7]Dong J W，Bingga G L，Sun M H，et al. Application of high-resolution melting curve analysis for identification of Muscovy duck parvovirus and goose parvovirus[J]. Journal of Virological Methods，2019，266：121-125.

[8]于天飛，謝鵬宇，尹海暢，等. 脊椎動物細小病毒衣殼結構研究進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2020（19）：25-30，167.

[9]Tu M，Liu P，Liu F，et al. Construction of expression vectors of capsid proteins from goose parvovirus and investigation of the immunogenicity[J]. Acta Virologica，2018，62（4）：415-423.

[10]于天飛，董慧瑩，黎 明，等. 番鴨細小病毒YL08株VP1基因的克隆及序列分析[J]. 畜牧與獸醫，2016，48（7）：40-43.

[11]高慎陽，查恩輝，王 珅，等. 一種“高性價比”切膠純化原核表達蛋白的方法[J]. 中國農學通報，2010，26（22）：24-26.

[12]汪家政，范 明. 蛋白質技術手冊[M]. 北京：科學出版社，2000.

[13]于天飛，董慧瑩，張喜文，等. 豬傳染性胃腸炎病毒血清抗體Dot-ELISA檢測方法的建立[J]. 中國預防獸醫學報，2018，40（10）：956-959.

[14]Yu T F，Li M. Identification of recombination among VP1 gene of Muscovy duck parvovirus from the Mainland of China[J]. Veterinary Microbiology，2016，195：78-80.

[15]Wang C Y，Shieh H K，Shien J H，et al. Expression of capsid proteins and non-structural proteins of waterfowl parvoviruses in Escherichia coli and their use in serological assays[J]. Avian Pathology，2005，34（5）：376-382.

[16]le Gall-Reculé G，Jestin V，Chagnaud P，et al. Expression of Muscovy duck parvovirus capsid proteins （VP 2 and VP 3） in a baculovirus expression system and demonstration of immunity induced by the recombinant proteins[J]. The Journal of General Virology，1996，77：2159-2163.B34FDA31-1A06-492A-ACC5-3C31F209EC5F