江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因克隆和表達分析

洪森榮 鄧雨晴 張玲 張妮 張雯齊 張新語 趙若雅 鄭潘鴦 鄭紫娟 周融冰

摘要：對江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因進行克隆和表達分析，以期為解析江西鉛山紅芽芋的抗病機制奠定基礎，同時為江西鉛山紅芽芋的遺傳改良提供候選基因。通過江西鉛山紅芽芋試管苗轉錄組數據庫篩選到江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因的核心片段，利用RT-PCR技術克隆江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因，并用生物信息學方法和實時定量PCR進行序列分析和器官表達分析。結果表明，江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因cDNA總長度為264 bp，G+C含量為46.59%;江西鉛山紅芽芋抗病蛋白由88個氨基酸組成，分子量為10 116.53 u，等電點為6.42，為親水性蛋白;二級結構由α-螺旋（23.68%）、β-片層（14.77%）、無規則卷曲（61.36%）構成;三級結構為單體;江西鉛山紅芽芋抗病蛋白主要存在于葉綠體和細胞核中;江西鉛山紅芽芋抗病蛋白在進化上與芋（Colocasia esculenta）的親緣關系較近，尤其是與芋的hypothetical peotein Taro_046555（MQM13626.1）、hypothetical peotein Taro_046554（MQM13625.1）和hypothetical peotein Taro_046553（MQM13630.1）在進化上具有最高的親緣關系。實時定量PCR結果顯示，抗病蛋白基因在江西鉛山紅芽芋中的表達存在器官特異性，在葉片和球莖膨大初期的表達量最高。綜合分析可知，江西鉛山紅芽芋抗病蛋白具有典型的抗病蛋白結構，在進化上高度保守。

關鍵詞：江西鉛山紅芽芋;抗病蛋白;基因克隆;表達分析

中圖分類號： S632.301? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）09-0021-06

江西鉛山紅芽芋（Colocasia esculenta L. Schoot var. cormosus‘Hongyayu）是江西省知名名優特農產品和國家地理標志農產品[1]，屬天南星科本草植物，藥食兼優[2-3]。自然界的各種微生物會對植物的生長發育造成一定的威脅，在與病原菌的長期共進化過程中，植物為免受病原微生物侵害形成了一套保護自身的免疫應答調控機制[4]。病原微生物分泌的效應蛋白可被抗病蛋白特異識別，從而觸發免疫響應，產生或激活能夠特異識別效應因子的抗性蛋白，從而減少病原微生物對植物的侵擾[5]。抗病蛋白可分為跨膜受體蛋白、蛋白激酶、絲氨酸/蘇氨酸激酶、毒素還原酶、核苷酸結合富含亮氨酸重復序列（nucleotide binding-leucine rich repeat，NB-LRR）抗病蛋白等5種;目前克隆到的抗病蛋白編碼基因大多屬于NB-LRR類，同屬于NB-LRR類抗病蛋白對應的編碼基因還有TNL（TIR-NB-LRR）和CNL（CC-NB-LRR）2類[6]。因此，克隆江西鉛山紅芽芋抗病蛋白編碼基因并檢測其組織表達特異性，對了解江西鉛山紅芽芋抗病品種選育具有重要意義。目前關于抗病蛋白（disease resistance protein）編碼基因的研究尚少見。Pit是一種對稻瘟病具有抗性的NLR蛋白，水稻GTPase OsRac1直接與Pit相互作用，Pit的活性形式誘導了質膜上OsRac1的激活，OsRac1參與了Pit介導的活性氧（ROS）產生和過敏反應（HR）過程，是水稻Pit介導的抗病性所必需的[7]。煙草花葉病毒抗性N基因是煙草花葉病毒復制酶中識別解旋酶結構域的Toll白細胞介素受體（TIR）-NBS-LRR類植物抗病基因的成員，N蛋白在誘導子的作用下發生寡聚，但P-環基序突變可消除寡聚作用。RNBS-A基序和TIR結構域的功能缺失突變保留了寡聚的能力，寡聚是N介導抗煙草花葉病毒（TMV）的一個早期事件[8]。植物免疫系統對病原菌的識別受抗病基因結構相關的多態產物控制。RAR1和/或SGT1b介導許多R蛋白的功能，RAR1通過一種未知的機制控制前激活R蛋白的積累;擬南芥SGT1b在植物免疫系統中具有2種不同的、在遺傳上可分離的功能：SGT1b拮抗RAR1，在感染前負調控R蛋白的積累;SGT1b具有RAR1獨立的功能，在感染過程中能夠調節細胞的程序性死亡;RAR1和SGT1的平衡活性與胞漿HSP90共同調節活化前R蛋白的積累和信號傳導能力[9]。擬南芥NPR1蛋白是調節水楊酸依賴性基因表達的關鍵蛋白，NPR1與基本結構域/亮氨酸（Leu）拉鏈轉錄因子TGACG基序結合因子（TGA）類成員有差異的相互作用，并調節其DNA的結合活性。TGA1基因中Cys-260和 Cys-266 的定點突變使其能與酵母、擬南芥中的NPR1相互作用，TGA1依賴于Cys殘基的氧化狀態來介導與NPR1的相互作用。TGA1的分子內二硫鍵包括與NPR1的相互作用，NPR1只能刺激TGA1還原態的DNA結合活性。與動物、酵母不同，TGA1的DNA結合活性不受氧化還原作用調節[10]。目前，對紅芽芋的研究主要集中在脫毒快繁[1]、微芋誘導[2]、下游加工[3]、成分分析[11]等方面，關于紅芽芋抗病蛋白方面的研究尚未見報道。本研究利用RT-PCR技術克隆江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因，并用生物信息學方法和實時定量PCR方法進行序列分析和組織表達分析，為揭示江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的生物學功能提供理論依據，為從分子水平選育江西鉛山紅芽芋抗病品種提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

江西鉛山紅芽芋試管苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 用TRIzol試劑提取江西鉛山紅芽芋試管苗的總RNA，提取步驟參照說明書，使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度和完整性。以提取獲得的RNA為模版，按照M-MLV cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。逆轉錄引物采用Oligo（dT）18 Primer：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具體步驟參考說明書。179323F0-4EAD-4CF4-A6AC-914F53E7F4B2

1.2.2 抗病蛋白基因的克隆 根據轉錄組組裝的Unigene序列信息（TRINITY_DN15482_c0_g1），用Primer Premier 5.0設計引物（F：5′-CGAGGATACACAGGTTCACGG-3′;R：5′-GAATTCTAACTTCTGGAGTTCTGGG-3′）。PCR擴增條件：95 ℃ 2 min;95 ℃ 30 s，54.1 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環;72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。將PCR產物回收，使pMD19-T載體與條帶（含有目的基因）連接，并用熱激法轉化感受態細胞大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α，提取陽性轉化子（鑒定正確）中的質粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 抗病蛋白基因的生物信息學分析 氨基酸序列用BioEdit軟件分析，酶的理化性質用ProtParam預測，酶的疏/親水性用ProtScale預測。使用GOR I軟件在線預測酶的二級結構。使用SWISS-MOLD在線預測酶的三級結構。采用WoLF PSORT在線預測基因的表達部位。通過DNAMAN和BioEdit軟件進行氨基酸序列比對，利用MEGA 5.0進行系統進化樹的構建。

1.2.4 抗病蛋白基因的組織表達分析 分別取500 ng江西鉛山紅芽芋試管苗根、莖、葉、試管球莖（初期、中期和末期）的RNA，將其反轉錄為cDNA。熒光定量PCR（qRT-PCR，SYBR Green Ⅰ）檢測的內參基因為GAPDH。設計的引物序列如下：F，5′-TGTGTCTCCCTCCAGTGCTCA-3′;R，5′-TTTCTCGCCCCCCCTGTTCA-3′;目標基因片段大小145 bp;變性溫度（T m）53.6 ℃。qRT-PCR檢測采用 20 μL 反應體系，PCR反應程序：95 ℃ 預變性 10 min;95 ℃ 變性 10 s，60 ℃ 復性34 s，72 ℃延伸 15 s，40個循環。用2-ΔΔC T法計算基因表達水平。試驗重復3次，所有數據表示為“平均值±標準差”，并用SPSS 19.0軟件進行統計分析，用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗抗病蛋白基因組織表達的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因的cDNA序列

RT-PCR擴增結果顯示，江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因cDNA總長度為264 bp，G+C含量為46.59%（圖1、圖2、圖3）。

2.2 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的氨基酸序列

用ProtParam預測的江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的氨基酸序列見圖4。江西鉛山紅芽芋抗病蛋白由88個氨基酸組成，分子量為10 116.53 u，等電點為6.42，為親水性蛋白。各氨基酸的數目和比例：丙氨酸（Ala，A）（5個，5.7%）、精氨酸（Arg，R）（7個，8.0%）、天冬氨酸（Asp，D）（3個，3.4%）、半胱氨酸（Cys，C）（4個，4.5%）、谷氨酰胺（Gln，Q）（6個，6.8%）、谷氨酸（Glu，E）（7個，8.0%）、甘氨酸（Gly，G）（6個，6.8%）、異亮氨酸（Ile，I）（4個，4.5%）、亮氨酸（Leu，L）（11個，12.5%）、賴氨酸（Lys，K）（3個，3.4%）、苯丙氨酸（Phe，F）（8個，9.1%）、脯氨酸（Pro，P）（3個，3.4%）、絲氨酸（Ser，S）（9個，10.2%）、蘇氨酸（Thr，T）（5個，5.7%）、色氨酸（Trp，W）（1個，1.1%）、酪氨酸（Tyr，Y）（4個，4.5%）、纈氨酸（Val，V）（2個，2.3%）。帶負電荷氨基酸殘基總數（Asp+Glu）為10個，帶正電荷氨基酸殘基總數（Arg+Lys）為10個。失穩指數（Ⅱ）計算為50.84，表明該蛋白屬于不穩定蛋白。

2.3 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的親疏水性分析

疏水區域用高峰值區域表示，其數值一般為正值;而親水區域用低谷區域表示，其數值一般為負值。從圖5可以看出，最大疏水值為2.00左右，說明相應位點的疏水性最強;最大親水值為-2.5左右，說明相應位點的親水性最強。江西鉛山紅芽芋抗病蛋白表現出高度親水性，說明該蛋白為親水性蛋白。

2.4 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的二級結構分析

由圖6、圖7可見江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的二級結構預測結果。GOR預測結果顯示，其二級結構由α螺旋（Hh，23.86%）、β-片層（Ee，14.77%）、無規則卷曲（Cc，61.36%）構成。從分布位點上看，C端、N端主要含有α-螺旋、無規則卷曲和β-片層，且無規則卷曲、β-片層和α-螺旋散布于整個蛋白中。

2.5 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白三級結構的分析

SWISS-MODEL預測結果（圖8）顯示，江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的三級結構為單體，多由 α-螺旋和無規則卷曲組成，與二級結構預測結果一致。

2.6 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的亞細胞定位

用WoLF POSRT在線軟件對江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因的表達部位進行預測，結果顯示，定位于葉綠體中的蛋白質數量為9個，定位于細胞核中的蛋白質數量為3個，定位于線粒體中的蛋白質數量為1個，定位于細胞質中的蛋白質數量為1個，表明江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因主要存在于葉綠體和細胞核中（圖9）。

2.7 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的系統進化分析

由構建的進化樹可以看出，江西鉛山紅芽芋與芋（Colocasia esculenta）在一個大分支下，說明江西鉛山紅芽芋抗病蛋白在進化上與C. esculenta的親緣關系較近，尤其是與C. esculenta hypothetical peotein Taro_046555（MQM13626.1）、hypothetical peotein Taro_046554（MQM13625.1）和hypothetical? peotein Taro_046553（MQM13630.1）在進化上具有較高的親緣關系（圖10）。179323F0-4EAD-4CF4-A6AC-914F53E7F4B2

2.8 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白同源蛋白的序列比對信息

江西鉛山紅芽芋抗病蛋白同源蛋白的序列比對信息見圖11，其中※號區域是該蛋白家族的保守結構域。氨基酸同源性、保守區域及進化關系顯示，芋抗病蛋白家族成員之間的氨基酸序列一致性較高，進一步證實：江西鉛山紅芽芋抗病蛋白在進化上與C. esculenta的親緣關系較近，尤其是與C. esculenta hypothetical peotein Taro_046555（MQM13626.1）、hypothetical peotein Taro_046554（MQM13625.1）和hypothetical peotein Taro_046553（MQM13630.1）在進化上具有較高的親緣關系。

2.9 江西鉛山紅芽芋不同器官及球莖膨大不同時期抗病蛋白基因的表達分析

由圖12可以看出，江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因在根、莖、葉中及在球莖膨大初期、中期、末期中均有表達，但在根、莖、葉中及球莖不同膨大期中的表達情況差異顯著，其中江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因在葉、球莖膨大初期的表達量最高。

3 結論與討論

為了應對復雜多變的環境，植物在生長發育過程中構建了不同層級（初級、次級）的免疫反應。初級免疫反應是指宿主細胞膜可以識別病原微生物的相關分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMP），PAMP觸發的免疫反應（PAMP triggered immunity，PTI）被激活[12-14]。次級免疫反應是指微生物為了應對植物的初級免疫反應，注入一些毒性因子（即效應因子）到植物細胞內，抑制PAMP觸發的免疫反應;為了避免感病，植物進化出抗病蛋白，抗病蛋白可特異性識別效應因子，效應因子觸發的免疫反應（effectors triggered immunity，ETI）被激活[15-16]。ETI比PTI更強烈和迅速，引起植物局部的程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD），導致植物發生超敏反應（hypersensitive response，HR），有效遏制病原菌進一步擴散[17]。本試驗利用同源克隆技術成功克隆了江西鉛山紅芽芋的抗病蛋白基因序列，江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因的cDNA總長度為264 bp，G+C含量為46.59%;江西鉛山紅芽芋抗病蛋白由88個氨基酸組成，分子量為10 116.53 u，等電點為6.42，為親水性蛋白;二級結構由α-螺旋（23.68%）、β-片層（14.77%）、無規則卷曲（61.36%） 構成;三級結構為單體;江西鉛山紅芽芋抗病蛋白主要存在葉綠體和細胞核中;江西鉛山紅芽芋抗病蛋白在進化上與芋的親緣關系較近，尤其是與芋的hypothetical peotein Taro_046555（MQM13626.1）、hypothetical peotein Taro_046554（MQM13625.1）和hypothetical peotein Taro_046553（MQM13630.1）在進化上具有較高的親緣關系。實時定量PCR結果顯示，抗病蛋白基因在江西鉛山紅芽芋中的表達存在器官特異性，在葉片、球莖膨大初期的表達量最高。由此可見，江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因的克隆和表達分析，可為解析江西鉛山紅芽芋的抗病機理奠定基礎，同時為江西鉛山紅芽芋遺傳改良提供候選基因。

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