HPLC 法測定替格瑞洛原料藥和替格瑞洛片的含量

蔡麗朋，周琪

江西青峰藥業有限公司，江西 贛州 341000

替格瑞洛是英國阿斯利康（Astra Zeneca）公司研發的一種新型選擇性小分子抗凝血藥物［1］，與阿司匹林合用治療急性冠狀動脈綜合征（ACS），降低心肌梗死和卒中的發生率［2］，相比已有的小分子抗凝血藥物更安全［3］。江西青峰藥業有限公司研發生產的替格瑞洛原料藥及片劑需要控制13個雜質，含量測定方法需要考慮替格瑞洛與這13個雜質的分離。文獻［4］提到了替格瑞洛原料藥含量測定的方法，但是其方法僅考慮了替格瑞洛與兩個雜質之間的分離度，方法適用性差。本研究建立了同時適用于替格瑞洛原料藥與替格瑞洛片含量測定的方法，并參照《中國藥典》2020 年版四部通則9101［5］和人用藥品注冊技術要求國際協調會（ICH）Q2［6］要求進行了方法學驗證，為產品的質量控制提供有效的手段。

1 儀器與材料

1.1 儀器

XS105DU 型電子天平（瑞典Mettler Toledo 公司）；KQ-300DE 型臺式數控超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設備有限公司）；Waters e2695-2489型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）。

1.2 試藥

替格瑞洛對照品［江西青峰藥業有限公司（以下簡稱自制），含量99.6%］；替格瑞洛原料藥（自制，含量99.8%）；替格瑞洛片（自制，規格：90 mg，含量97.0%）；雜質A 對照品（自制，含量99.32%）；雜質B 對照品（自制，含量98.85%）；雜質C 對照品（自制，含量98.84%）；雜質D 對照品（自制，含量98.86%）；雜質E 對照品（自制，含量99.36%）；雜質F 對照品（自制，含量98.69%）；雜質G 對照品（自制，含量97.73%）；雜質H 對照品（自制，含量98.93%）；雜質I 對照品（自制，含量98.77%）；雜質J 對照品（自制，含量99.07%）；雜質K 對照品（自制，含量99.58%）；雜質L 對照品（煙臺普里醫藥技術有限公司，含量99.69%）；雜質M 對照品（自制，含量98.65%）；乙腈為色譜純，磷酸二氫鈉一水合物，磷酸二氫鈉二水合物，磷酸等其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

磷酸鹽緩沖液配制：稱取磷酸二氫鈉一水合物138 g 或磷酸二氫鈉二水合物156 g，加水1 000 mL溶解，用稀磷酸調pH 值至3.0，得1.0 mol/L 的磷酸二氫鈉溶液；取1.0 mol/L 磷酸二氫鈉溶液10 mL，加水至480 mL，搖勻。色譜柱為Aglient Zorbax SB C18 mm（150 mm×4.6 mm,1.8 μm），流動相A：乙腈，流動相B：磷酸鹽緩沖液，梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：55 ℃；檢測波長：242 nm；進樣體積：5 μL。梯度洗脫表見表1。

表1 梯度洗脫表

2.2 溶液配制

（1）空白溶劑：35%乙腈。（2）原料藥供試品溶液配制：取替格瑞洛原料藥適量，精密稱定，加空白溶劑溶解并定量稀釋制成每1 mL 含替格瑞洛0.5 mg 的溶液。（3）片劑供試品溶液配制：取替格瑞洛片5 片，置100 mL 量瓶中，加空白溶劑約50 mL，超聲15 min，放冷，用空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液1.0 mL 置10 mL 量瓶中，用空白溶劑稀釋至刻度，搖勻。（4）替格瑞洛片空白輔料溶液配制：取處方量的空白輔料1 050 mg，置100 mL 量瓶中，其余操作同替格瑞洛片供試品溶液配制。（5）對照品溶液配制：取替格瑞洛對照品適量，精密稱定，加空白溶劑溶解并定量稀釋制成每1 mL含替格瑞洛0.5 mg 的溶液。（6）系統適用性溶液配制：取替格瑞洛有關物質方法項下控制的雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G、雜質H、雜質I、雜質J、雜質K、雜質L、雜質M對照品，替格瑞洛對照品各適量，精密稱定，加空白溶劑溶解并逐步定量稀釋制成每1 mL 含雜質A至雜質M 各0.75 μg，替格瑞洛0.5 mg 的溶液。

2.3 專屬性

分別進樣空白輔料溶液、替格瑞洛對照品溶液、替格瑞洛原料藥供試品溶液、替格瑞洛片供試品溶液色譜圖及系統適用性實驗考查，各溶液色譜圖見圖1～5。

圖1 空白輔料溶液色譜圖

從圖中可知，空白輔料溶液、有關物質項下控制的雜質A～雜質M 不干擾替格瑞洛的測定，替格瑞洛的保留時間為6.232 min，最小分離度為3.4，系統適用性良好，專屬性強。

圖2 替格瑞洛對照品溶液色譜圖

圖3 原料藥供試品溶液色譜圖

圖4 片劑供試品溶液色譜圖

圖5 系統適用性溶液色譜圖

2.4 精密度試驗

取對照品溶液，依法連續進樣6 次，替格瑞洛的保留時間RSD 為0.04%，峰面積RSD 為0.11%。結果表明儀器進樣精密度良好。

2.5 線性與范圍

取替格瑞洛對照品適量，精密稱定，加空白溶劑溶解并稀釋成系列標準溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，結果在101.417～811.334 μg/mL 濃度范圍內，峰面積（A）與替格瑞洛濃度（C）有良好的線性關系，回歸方程為A=5 907.6C+28 789，r=0.999 9。

2.6 重復性試驗

2.6.1 原料藥的重復性試驗由實驗員A 配制6 份供試品溶液，依“2.1”項下色譜方法測定；由實驗員B 在不同的時間配制6 份供試品溶液，采用不同的儀器，依“2.1”項下色譜方法測定，比較12 份樣品的檢測結果：實驗人員A 測定6 份供試品溶液含量均值為100.2%，RSD 為0.48%；實驗人員B 測定6 份供試品溶液含量均值為99.5%，RSD 為0.18%；12 份供試品溶液含量RSD 為0.44%。

2.6.2 片劑的重復性試驗由實驗員A 配制6 份供試品溶液，依“2.1”項下色譜方法測定；由實驗員B 在不同的時間配制6 份供試品溶液，采用不同的儀器，依“2.3”項下色譜方法測定，比較12 份樣品的檢測結果：實驗人員A 測定6 份供試品溶液含量均值為97.0%，RSD 為0.35%；實驗人員B 測定6 份供試品溶液含量均值為97.6%，RSD 為0.42%；12 份供試品溶液含量RSD 為0.48%。

2.7 回收率試驗

2.7.1 原料藥回收率取替格瑞洛對照品適量，精密稱定，配制成進樣濃度80%、100%、120%的3 種濃度的樣品溶液，每個濃度平行3 份，依法進樣檢測，9份供試品溶液的平均回收率為99.9%，RSD為0.89%。

2.7.2 片劑回收率取替格瑞洛對照品適量和處方量的輔料，精密稱定，配制成進樣濃度80%、100%、120%的3 種濃度的樣品溶液，每個濃度各3 份，依法進樣檢測，9 份供試品溶液的平均回收率為100.3%，RSD 為0.41%。

2.8 溶液穩定性

依法配制原料藥供試品溶液、片劑供試品溶液與對照品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、12 h、24 h、32 h、40 h、48 h 進樣，考察穩定性。對照品溶液在48 h 內，主峰峰面積RSD 為1.10%，保留時間RSD 為0.68%；原料藥供試品溶液在48 h 內，主峰峰面積RSD 為1.24%，保留時間RSD 為0.69%；片供試品溶液在48 h 內，主峰峰面積RSD 為0.68%，保留時間RSD 為0.10%。結果表明原料藥供試品溶液、片劑供試品溶液及對照品溶液在室溫條件下放置，至少48 h 內穩定。

2.9 耐用性

依法配制空白溶劑、空白輔料溶液、原料藥供試品溶液、片劑供試品溶液、對照品溶液及系統適用性溶液，微小改變色譜條件，依法檢測，考察方法耐用性。各個測試條件下，空白溶劑、空白輔料及有關物質項下控制的其他雜質對替格瑞洛檢測均無干擾，結果見表2。

表2 耐用性考察結果

結果表明：微小改變流速、柱溫、流動相水相pH 值及使用不同批次色譜柱，不會對檢測結果造成影響，方法的耐用性良好。

2.10 樣品測定

分別取替格瑞洛原料藥和替格瑞洛片，按“2.2”項下分別配制供試品溶液，依“2.1”項下色譜條件測定。計算結果見表3。

表3 樣品的測定結果

3 結論

本研究建立了同時適用于替格瑞洛原料藥與替格瑞洛片含量測定的方法，本法精密度好，準確度高、分析時間短、穩定性良好，能夠同時滿足替格瑞洛原料藥和替格瑞洛片商業化生產中替格瑞洛含量的檢測要求，以便更好地控制產品的質量。