基于生物信息學分析prohibitin在腎透明細胞癌中的表達及意義

楊文軍，朱煒瑋

1解放軍總醫院第六醫學中心急診醫學科，北京 100048

2解放軍總醫院第七醫學中心泌尿外科，北京 100027

腎細胞癌也稱為腎癌，是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一，流行病學統計數據顯示，腎癌的發病率、病死率均呈逐漸上升趨勢[1]。腎透明細胞癌是最常見的腎癌類型，發病率占全部腎癌的75%[2]。目前，手術仍是早期腎透明細胞癌的首選治療方法。轉移性晚期腎透明細胞癌患者對放化療的敏感性較差，可選擇的治療方法較少。即使早期接受手術治療，亦有20%～50%的患者存在復發風險，30%的患者存在遠處轉移風險[3-4]。因此，需要探索一種新的腎透明細胞癌治療策略，如分子靶向治療，但僅20%～40%的腎透明細胞癌患者對現有的靶向治療有效[5]，且其長期生存率并未發生明顯改善[6]。因此，需尋求新的與患者臨床特征及預后相關的基因，為腎透明細胞癌的治療提供新的靶點與目標。

prohibitin（PHB）屬于SPFH家族成員，廣泛參與正常細胞增殖、遷移和凋亡等生理學過程，在肥胖、衰老、腫瘤發生發展等過程中發揮了重要作用[7-9]。有研究表明，PHB是一種潛在的抑癌基因，可以影響膀胱癌、食管癌等腫瘤細胞增殖、轉移過程[10]。但目前有關PHB在腎透明細胞癌中的表達及與腫瘤發生發展的關系尚未明確。本研究基于生物信息學分析PHB在腎透明細胞癌中的表達及臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 PHB基因表達水平分析

通過癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫、人類蛋白質圖譜（Human Protein Atlas，HPA）數據庫（http:/www.proteinatlas.org）[11]檢索PHB基因，條件設定為tissue，可獲得PHB基因在人體不同組織中的表達水平。通過UALCAN數據庫（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）[12]分析PHB基因在腎透明細胞癌組織和正常腎臟組織中的表達水平，設置參數：基因PHB，腫瘤類型kidney renal clear cell carcinoma，分型類型選擇expression。

1.2 PHB基因表達水平與腎透明細胞癌患者臨床特征和預后的關系

通過UALCAN數據庫評估PHB基因表達水平與腎透明細胞癌患者臨床特征的關系，包括性別、淋巴結轉移情況和分化程度。通過基因表達譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）[13]分析PHB基因表達水平與腎透明細胞癌患者生存情況的關系。設置參數：基因PHB，腫瘤類型為kidney renal clear cell carcinoma，生存分析類型為overall survival；取cut-off-high（%）為50%，cut-offlow（%）為50%。

1.3 PHB基因相互作用靶點的獲取及蛋白質互作（proteinprotein interaction，PPI）網絡的構建

通過 String數據庫（https://string-db.org/）[14]檢索出20個與PHB基因相互作用的關鍵蛋白，構建PPI網絡，物種類型設定為human，置信度選擇“Medium 0.4”，相互作用最大數選擇20。

1.4 基因本位（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析

將交集基因輸入在線網站DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）進行GO、KEGG分析。

1.5 統計學方法

通過TCGA、UALCAN、String等數據庫統計數據，非正態分布計量資料以中位數（四分位數）[M（P25，P75）]表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PHB基因相對表達量的比較

通過HPA數據庫分析PHB基因在人體正常組織中的表達情況顯示，PHB在腎臟、甲狀腺及心臟組織中高表達，在正常腎臟組織中的表達豐度較高，提示PHB在腎臟組織中可能發揮了重要作用。同樣，本研究通過UALCAN數據庫分析PHB基因在腎透明細胞癌（n=72）及正常腎臟組織中（n=533）的表達情況，結果顯示，PHB基因在腎透明細胞癌組織中的相對表達量為118.001（101.249，137.871），明顯低于正常腎臟組織的209.904（190.427，237.008），差異有統計學意義（P＜0.01）。（圖1）

圖1 PHB在人體各組織中的表達豐度

2.2 不同臨床特征腎透明細胞癌患者腫瘤組織中PHB基因相對表達量的比較

不同淋巴結轉移情況腎透明細胞癌患者腫瘤組織中PHB基因相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；男性、未分化腎透明細胞癌患者腫瘤組織中PHB基因相對表達量分別低于女性、低中高分化患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 533例不同臨床特征腎透明細胞癌患者腫瘤組織中PHB基因的相對表達量[M（P25，P75）]

2.3 PHB基因相對表達量與腎透明細胞癌患者預后的關系

依據PHB基因相對表達量，取cut-off-high（%）為50%，cut-off-low（%）為50%，將腎透明細胞癌患者分為PHB高表達組（n=258）和PHB低表達組（n=258），因部分患者隨訪資料不全，因此總例數少于533例，結果顯示，PHB低表達組腎透明細胞癌患者總生存期短于PHB高表達組，差異有統計學意義（P＜0.05），表明PHB低表達可能與患者的預后不良相關。（圖2）

圖2 PHB高表達組（n=258）和PHB低表達組（n=258）腎透明細胞癌患者的總生存曲線

2.4 PHB相互作用蛋白的PPI網絡

將PHB基因相互作用的交集靶點導入String數據庫，得到PPI網絡，共篩選出20個PHB基因相互作用的蛋白，分別為SPG7、AFG3 ATP酶家族基因3樣2多克隆抗體（AFG3 like matrix AAA peptidase subunit 2，AFG3L2）、PHB2、內質網脂質Raft關聯蛋白（ER lipid raft associated，ERLIN）1、ERLIN2、SOS-Ras/Rac鳥嘌呤核苷酸交換因子1（SOS Ras/Rac guaninenucleotide exchange factor1，SOS1）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、磷脂酰肌醇-4，5二磷酸 3-激酶催化亞單位γ（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma，PIK3CG）、鳥嘌呤核苷酸解離刺激因子（Ral guanine nucleotide dissociation stimulator，RALGDS）、MLLT4、重組人Ras相關蛋白Krev-1（Ras-related protein Krev-1，RAP1A）、酪氨酸3-加單氧酶/色氨酸5-加單氧酶激活蛋白（tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein，delta polypeptide，YWHAZ）、酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白β（tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein beta，YWHAB）、迅速加速纖維肉瘤1（rapidly accelerated fibrosarcoma 1，RAF1）、鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1（vraf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）、磷脂酰肌醇-4，5二磷酸3-激酶催化亞單位α（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA）、Harvery鼠肉瘤病毒癌基因（v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog，HRAS）、鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）、絲裂原活化蛋白激酶 1（mitogen-activated protein kinase 1，MAP2K1）、酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白eta（tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein eta，YWHAH）。（圖3）

圖3 PHB相互作用蛋白的PPI網絡

2.5 GO分析結果

對20個蛋白對應的基因進行GO分析，結果顯示，細胞成分主要集中于細胞內液、細胞質、細胞質膜及線粒體等，生物進程主要集中于細胞內信號轉導、細胞死亡調控及細胞凋亡調控等，分子功能主要集中于蛋白結合、ATP結合、蛋白酶激活等。（圖 4）

圖4 GO分析結果

2.6 KEGG通路富集分析結果

對這20個蛋白對應的基因進行KEGG通路富集分析，結果顯示，這些基因主要富集于磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路、免疫反應相關通路等。（圖5）

圖5 KEGG通路富集分析結果

3 討論

相關研究顯示，腎癌發病率占所有惡性腫瘤的2%～3%[15]。腎透明細胞癌作為腎癌中最常見的類型，在中國及全球的發病率也不斷上升。2020年，腎透明細胞癌每年新發病例超過40萬例，病死超過15萬例[16]。早期腎透明細胞癌患者主要采用外科手術治療，而中晚期患者多已經失去了最佳的手術治療時機。因此，尋找一種早期診斷及預后評估的相關分子標志物迫在眉睫。

PHB基因廣泛表達于細胞核、細胞質、細胞膜及線粒體上[17-18]。已有研究表明，PHB參與調節細胞周期、細胞凋亡、DNA轉錄等多種生理過程[19]。PHB可以通過調控E2F、Rb等轉錄因子的表達及RAS/RAF/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）/細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路參與細胞周期的調節，而促凋亡機制主要通過對細胞線粒體、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）等凋亡相關蛋白的調控完成[20]。研究顯示，PHB在乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的發生發展、轉移過程中發揮了重要作用[21-22]，但關于PHB基因在腎癌中表達及在腎癌發展過程中的作用機制均未見相關研究報道。

本研究利用TCGA數據庫中腎透明細胞癌相關數據，分析PHB基因在腎透明細胞癌中表達及與患者臨床特征和預后的關系，結果顯示：①通過HPA數據庫發現，PHB在正常腎臟組織中高表達，提示其在腎臟正常生理過程中可能發揮了重要作用，但通過UALCAN數據庫中分析PHB基因在正常腎臟組織及腎癌組織中的表達情況發現，PHB在腎透明細胞癌組織中明顯低表達。②通過UALCAN數據庫分析PHB與腎透明細胞癌患者臨床特征的關系發現，PHB的表達水平與腎透明細胞癌患者淋巴結轉移情況無關，與性別、分化程度有關。③通過GEPIA數據庫分析PHB與腎透明細胞癌患者預后的關系發現，PHB低表達組腎透明細胞癌患者總生存期短于PHB高表達組。④通過String數據庫篩選出20個與PHB基因相互作用的蛋白質，其對應基因通過DAVID在線進行GO及KEGG富集分析，結果顯示，PHB的表達可能與細胞凋亡、細胞黏附、免疫耐受有關；PI3K/AKT通路可能參與了細胞增殖及凋亡過程，可明顯促進腫瘤細胞生長，與肝癌、卵巢癌的發生發展密切相關[23]，而PHB是否通過PI3K/AKT通路在腎透明細胞癌發生發展、轉移過程中發揮作用至今仍未見報道，可考慮作為以后研究的一個方向。

綜上所述，本研究基于TCGA等數據庫，通過對腎透明細胞癌中PHB相關信息的分析發現，PHB基因在腎透明細胞癌組織中低表達，且其表達水平與患者的預后有關，表明PHB對腎透明細胞癌的診斷、分期、分級、治療及預后評估均有較高的價值。雖然通過相關數據分析可以為PHB與腎透明細胞癌關系的研究提供相關線索，但其具體的作用機制、信號通路仍需要進一步的基礎實驗去證實，使PHB成為一種新的分子標志物應用于臨床對腎透明細胞癌的早期診斷、治療及預后評估成為可能。