細菌全基因組測序技術用于沙門氏菌流行病學調查的可行性分析

林本夫，任欣悅，袁曉琪，梁夢詩，丘穗萍，潘婧淇，原麗紅

（1.廣州市花都區動物衛生監督所，廣東廣州 510800；2.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東廣州 510006）

食源性疾病一直是全球廣泛關注的公共衛生問題之一[1]。據統計[2]，每年有6億人患食源性疾病，其中42 萬人死亡，每10 人中就約有1 人患病。其中，由沙門氏菌（Salmonella）引起的食物中毒人數居我國食源性致病菌致病人數的首位[3]。當前沙門氏菌實驗室診斷方法（GB 4789.4—2016）[4-5]成本高、周期長，對操作人員技術要求高，不能滿足基層高通量、快速、低成本的檢測需求[6]。全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）以特異性基因差異來表征菌株之間的差異，具有顯著的分型優越性[7]，并且可以快速詳盡地得到耐藥細菌的特征，是檢測細菌耐藥性的有效技術手段，極大克服了傳統方法的局限性[8-9]。

前期對分離到的9株沙門氏菌進行了傳統的血清分型和耐藥性分析[10]。本研究以這9株沙門氏菌為研究對象，通過全基因組測序預測其血清型和耐藥基因，進而將全基因組測序結果與傳統檢測結果進行對比，評價兩者結果的一致性和各自優缺點，探討全基因組測序技術在沙門氏菌基層檢測和監控工作中的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

從豬、禽屠宰場環境樣品中分離得到9株沙門氏菌，其中6株來自生豬屠宰場（土壤2株、污泥2株、屠宰車間拭紙2株），3株來自禽類屠宰場（土壤1株、污泥1株、屠宰車間拭紙1株），具體采樣和分離方法見參考文獻[10]。

1.2 方法

1.2.1 全基因組測序 9株沙門氏菌全基因組測序，由廣東美格基因科技有限公司（中國廣州）完成。提取細菌基因組DNA，對DNA 進行完整性和純度檢測；使用NEB Next UltraTMDNA Library Prep Kit（Illumina）進行建庫和質檢；利用Ilumina Novaseq 6000 平臺對文庫進行測序，生成150 bp的對端序列。

1.2.2 基因組數據質控、拼接和組裝 對沙門氏菌基因組測序原始數據，采用FastQC 質控分析合格后，通過SPAdes_3.14.1（https://github.com/ablab/spades）進行拼接組裝，去除＜200 bp的重疊群片段；用RAST（rapid annotation using subsystem technology，https://rast.nmpdr.org/rast.cgi）統計沙門氏菌基因組大小、GC 含量等信息。

1.2.3 血清型預測和MLST 分型 根據全基因組測序結果，通過SeqSero 1.2（https://cge.cbs.dtu.dk/services/SeqSero/）進行血清型預測，同時在沙門氏菌基因組中檢索7 個看家基因（aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA），將序列上傳至MLST 2.0（https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/）中，與數據庫中原有的等位基因型序列進行比對，得到每個管家基因的編號，將其組合后得到對應的序列型（sequence type，ST）。

1.2.4 耐藥基因分析 基于9株沙門氏菌的全基因組測序分析結果，采用ResFinder 3.2（https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/）對菌株基因組所包含的耐藥基因進行預測。耐藥基因預測參數為ID ＞90%，且序列長度大于目的基因長度的60%；基因組組裝中，去掉覆蓋度＜20 的節點。

1.2.5 與傳統分析結果對比 將9株沙門氏菌全基因組測序結果與傳統血清分型和耐藥性檢測結果進行對比。傳統血清分型和耐藥性檢測，根據GB4789.4—2016 對樣品進行增菌/選擇性培養基培養、篩選，隨后經PCR 擴增、測序鑒定，利用傳統血清分型方法對沙門氏菌O/H 多價和單因子血清型鑒定；根據行標WS/T639—2018 選擇慶大霉素（GEN）、氟苯尼考（FFC）、環丙沙星（CIP）、阿莫西林（AMX）、氨芐西林（AMP）、諾氟沙星（NFX）、頭孢噻吩（CEF）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢曲松（CRO）、頭孢他啶（CAZ）、氨曲南（ATM）、亞胺培南（IPM）等12 種臨床常用抗菌藥物，對沙門氏菌分離株進行抗藥性分析。具體檢測方法及結果判定參考文獻[10]。

2 結果

2.1 全基因組測序

9株沙門氏菌編號分別為P-SSL1、P-SSL2、P-SSL3、P-SSL4、P-SSO1、P-SSO3、A-SSL3、A-SSL1、A-SSL4，基因組總長度為4 738 737～5 161 611 bp，基因平均長度為41 964.3～103 016 bp，GC 含量平均為52.06%。其中：P-SSL1、P-SSL2 的GC 含量最少，為51.9%；P-SSL3、P-SSL4 的GC 含量最多，為52.2%；A-SSL1 大于200 bp 的重疊群片段數量最少，僅46 條，基因組長度也最短，僅4 738 737 bp；P-SSL2 大于200 bp 的重疊群片段數量最多，為123 條，基因組長度也最長，為5 161 611bp。具體結果見表1。

2.2 血清型預測和MLST 分型

9株沙門氏菌中共預測到3 種血清型和ST型，分別是鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium，ST34）、德爾卑沙門氏菌（S.derby，ST40）、腸炎沙門氏菌（S.enteritidis，ST11），具體見表1。其中：鼠傷寒沙門氏菌為優勢血清型，占55.56%（5/9），其次為德爾卑沙門氏菌和腸炎沙門氏菌，均占22.22%（2/9）。分離自豬屠宰場的6株沙門氏菌中，有5株鼠傷寒沙門氏菌、1株德爾卑沙門氏菌；來自禽屠宰場的3株沙門氏菌中，有2株腸炎沙門氏菌、1株為德爾卑沙門氏菌（表2）。

2.3 耐藥基因預測

通過對9株沙門氏菌全基因組進行耐藥基因分析，得到7 大類抗菌藥物共22 種耐藥基因，包括氨基糖苷類[aac（3）-IVa、aph（3′）-Ia、aph（4）-Ia、aadA1、aadA2、aadA3、strA、strB]、β-內酰胺類（blaTEM-1B、blaOXA-1）、氯霉素類（floR、catB3、cmlA1）、喹諾酮類[qnrS2、aac（6′）Ib-cr]、利福平（ARR-3）、磺胺類（sul1、sul2、sul3、dfrA12）、四環素類[tet（A）、tet（B）]。其中：氨基糖苷類耐藥基因中攜帶率最高的是strA和strB基因，攜帶率均為66.67%（6/9）；β-內酰胺類耐藥基因中攜帶率最高的是blaTEM-1B基因，攜帶率為66.67%（6/9）；磺胺類耐藥基因中攜帶率最高的是sul2基因，攜帶率為88.89%（8/9）；其余種類耐藥基因攜帶率均不超過55.56%。在預測的所有耐藥基因中，攜帶率最高的耐藥基因是磺胺類的sul2基因（88.89%），攜帶率最低的是氨基糖苷類的aadA3基因（11.11%）。不同菌株間耐藥基因差異較大，在22 種耐藥基因中，有10 種耐藥基因的檢出率超過55.56%；9株沙門氏菌均攜帶3 種及以上的耐藥基因。具體結果見表1。

2.4 與傳統分析結果對比

利用傳統血清分型方法共鑒定出鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、德爾卑沙門氏菌3 種血清型。其中分離自豬屠宰場的6株沙門氏菌中，有5株鼠傷寒沙門氏菌、1株德爾卑沙門氏菌；來自禽屠宰場的3株沙門氏菌中，有2株腸炎沙門氏菌、1株為德爾卑沙門氏菌。基于全基因組測序預測的血清分型結果與傳統的血清分型結果[10]一致（表2）。

表2 基于全基因組測序的血清分型結果與傳統血清分型結果對比

傳統試驗時選擇了基層畜禽養殖實踐中常用的4 類（β-內酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類和氯霉素類）12 種抗菌藥物，對9株沙門氏菌進行藥敏試驗（表3），發現9株沙門氏菌對阿莫西林和氨芐西林完全抗藥，豬屠宰場分離到的6株沙門氏菌中有4株對慶大霉素耐藥，有3株對氟苯尼考耐藥；禽屠宰場分離到的3株沙門氏菌中有1株對慶大霉素、氟苯尼考和環丙沙星耐藥。而基于細菌全基因組數據的耐藥基因分析結果顯示，共檢測到7 大類22 種耐藥基因，其中針對β-內酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類和氯霉素4 類抗菌藥物的檢測結果與傳統檢測方法結果一致。全基因組測序與耐藥性分析對比結果表明，β-內酰胺類、氯霉素類、喹諾酮類和氨基糖苷類藥物的耐藥表型[10]與耐藥基因的檢測結果符合率為100%，即所有耐藥菌株中均檢測到相應的耐藥基因。此外，全基因組測序預測到利福平、磺胺類和四環素3 大類抗菌藥物的7 個耐藥基因，表明9株沙門氏菌可能對這3 大類抗菌藥物耐藥。

表3 基于全基因組測序的耐藥基因分析與藥敏實驗結果對比

3 討論

沙門氏菌作為主要的食源性病原菌，嚴重威脅著人類健康。由于沙門氏菌分型多且復雜[11]，加之長期使用某種抗菌藥物甚至濫用抗菌藥物導致（多重）耐藥菌株出現，尤其是在畜牧業養殖中，為防治疾病感染，促進動物生長，大量的抗菌藥物被用作飼料添加劑，使得基層沙門氏菌病防控工作面臨嚴峻挑戰[12-13]。

對沙門氏菌進行快速準確的分型和耐藥判斷，針對性地指導臨床用藥，對于沙門氏菌病防控尤為重要[14]。臨床上常用的傳統血清分型方法是通過玻片凝集法確定O 抗原和H 抗原[15]，然后根據沙門氏菌血清抗原表確定血清型。此方法對血清質量要求高，且花費大、用時長、人工成本高；對某些凝集不明顯難以進行判別的情況依賴于技術人員的經驗積累，容易造成誤判；此外，某些罕見血清型由于缺少特異診斷血清，常常難以檢測。相比之下，基于全基因組測序的分型方法，針對細菌特異性基因的差異來表征菌株之間的差異，用時短，準確率高，避免了常規血清分型中主觀判斷的影響，同時對傳統血清學檢測技術無法鑒定的菌株也可以進行分析，是一種高分辨率的分型方法。分子分型技術（如MLST、cqMLST、wgMLST 等）隨著基因組時代的來臨將成為當前細菌分型研究的熱點[16]。

監測沙門氏菌耐藥性，研究其耐藥形成主要機制，對沙門氏菌病的預防和控制具有重要意義。沙門氏菌耐藥性一般分為天然耐藥和獲得性耐藥。天然耐藥是細菌的固有特性和賴以生存的基本條件；獲得性耐藥主要是由于長期藥物使用而逐漸形成，主要由可以轉移的DNA（轉座子或者質粒）介導，可以水平傳播[17]。沙門氏菌耐藥性種類的增多，加大了依賴抗菌藥物治療沙門氏菌病和基層沙門氏菌病防控工作的難度，因此在食源性動物飼養過程中抗菌藥物的使用應嚴格限制并遵守休藥期，以減少細菌耐藥性的產生，保障食品安全和人類健康[18]。

實驗室在進行耐藥性分析時，主要基于當地抗菌藥物使用情況選擇性進行藥敏分析，無法進行大規模藥敏試驗，且該方法培養周期長，易受培養基、培養條件、人員操作等因素的影響。全基因組測序準確率高，操作簡便，用時更短，預測耐藥基因范圍更廣，而且ResFinder 抗性基因數據庫在預測耐藥基因方面可以檢出更多的耐藥基因，是耐藥性分析的首選工具。耐藥基因對耐藥性的預測也為明確耐藥機制以及耐藥性的檢測提供了新的視角和方法[19]。當出現新的血清型或耐藥基因時，可直接通過全基因組測序數據進行檢索和分析，無需再次進行常規的細菌培養鑒定，為沙門氏菌血清型和耐藥性的分析提供了更加簡便的方法。

食品安全問題在我國乃至全球已經成為一個重要的公共衛生問題，食源性致病菌作為食品安全的一個主要因素逐漸受到人們的重視。為確保我國食品安全，保證人民健康，防止食源性感染的發生，需要開展廣泛的流行病學調查，建立完善的食源性疾病監測網絡[19]。全基因組測序技術已應用于細菌性傳染病暴發調查和流行病學分析中，如2010年海地地震后的霍亂暴發菌株溯源，2011 年發生在歐洲的O104:H4 大腸埃希菌暴發事件調查，發生在加拿大持續3 年的結核病暴發分析，新生兒重癥監護室耐甲氧西林金黃色葡萄球菌暴發的調查，耐碳青霉烯類抗菌藥物肺炎克雷伯菌醫院內感染暴發調查等[20]。此技術在沙門氏菌流行病學中為抗病、生長、食欲、代謝調節、表型、環境適應機制及重要經濟性狀基因的分析提供重要數據，促進了對畜禽遺傳資源的深入研究與利用[21]。

隨著全基因組測序的不斷成熟，以及數據庫的不斷完善，會出現更多基因數據庫和研究軟件，為今后的研究提供了便捷[22]。基于全基因組測序的沙門氏菌分型和耐藥性分析方法的檢測成本和周期也將會進一步降低，測序速度、測序讀長也將會進一步增加，細菌分型和耐藥基因分析范圍會更廣，能夠滿足基層沙門氏菌病防控的高通量、快速、低成本的需求，從而指導沙門氏菌病防控的用藥。因此，基于全基因組測序開發操作簡單、低成本、高效、快速的沙門氏菌分型和耐藥性分析方法，在沙門氏菌流行病學調查和基層疫病防控具有一定的應用價值，相信全基因組測序也會被廣泛應用于更多物種的基因組研究。