云南省某養(yǎng)雞場鼻氣管鳥桿菌核酸檢測及其16S rDNA 基因序列分析

胡 騎，張振興，宋建領(lǐng)

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224）

鼻氣管鳥桿菌病是由鼻氣管鳥桿菌（Ornithobacterium rhinotracheale，ORT）引起禽類的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病，雞和火雞易感。該病以呼吸困難、生長障礙及嚴(yán)重的纖維素性化膿性肺炎和氣囊炎為特征。ORT 常與禽流感病毒（AIV）、大腸桿菌、傳染性鼻氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）等病原混合或繼發(fā)感染，導(dǎo)致感染雞群生長緩慢，死亡率增加，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1-2]。該病原1981 年由德國學(xué)者發(fā)現(xiàn)，1994 年比利時學(xué)者建議使用“鼻氣管鳥桿菌”這個術(shù)語，之后在美國、德國、英國、法國、以色列、荷蘭、南非等許多國家被發(fā)現(xiàn)[3]。2000年陳小玲等[4]在我國首次分離到ORT。泰國、伊朗以及我國臺灣地區(qū)進(jìn)行流行病學(xué)和血清型調(diào)查，發(fā)現(xiàn)ORT 陽性率很高。目前該病分布廣泛，可能呈世界性蔓延[5]。本研究對云南省易門縣某養(yǎng)雞場能導(dǎo)致相似臨床癥狀的相關(guān)病原進(jìn)行核酸檢測，證實病原為ORT，經(jīng)16S rDNA 基因序列分析，發(fā)現(xiàn)病原變異較少，這對于指導(dǎo)該地區(qū)雞群細(xì)菌病防控具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2020 年12 月初，云南省易門縣某養(yǎng)雞場出現(xiàn)大量流鼻涕、打噴嚏、面部腫脹、食欲下降和生長緩慢等癥狀的雞只。12 月9 日，取病死肉雞鼻腔黏液及肺、氣管等組織，混合剪碎研磨，按照體積比1:10 加入PBS，反復(fù)凍融3 次后，3 000 r/min 離心10 min，取上清液提取核酸。

1.1.2 試劑 RNA/DNA 核酸提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0，膠回收試劑盒TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0，PCR 試劑盒PremixTaq（TaKaRaTaqVersion 2.0 plus dye），RT-PCR 試劑盒PrimeScript Onestep RT-PCR Kit Ver.2，均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 按照RNA/DNA 核酸提取試劑盒說明書，提取組織上清液核酸。

1.2.2 引物合成 根據(jù)國內(nèi)外已發(fā)表的ORT、ILTV、AIV、雞副嗜血桿菌（ICV）基因序列及相關(guān)文獻(xiàn)[6]，分別設(shè)計檢測引物，檢測能引起肉雞呼吸道癥狀的上述常見病原核酸。引物序列信息見表1。

表1 病原核酸檢測引物序列

1.2.3 病原核酸檢測 通過RT-PCR/PCR 方法分別檢測AIV、ILTV、ORT、ICV 核酸。AIV 的RT-PCR 擴增體系（25.0 μL）：2×1 Step Buffer 12.5 μL、RNase Free dH2O 8.5 μL、上游引物（AIV-F）0.5 μL、下游引物（AIV-R）0.5 μL、Prime Script 1 Step Enzyme Mix 1.0 μL、模板RNA 2.0 μL。RTPCR 擴增程序：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。其他各病原（ILTV、ORT、ICV）的PCR 擴增體系（25.0 μL）：rTaq12.5 μL，RNase Free dH2O 9.5 μL，病原的上、下游引物均為0.5 μL，模板DNA 2.0 μL。PCR 擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，觀察結(jié)果。

1.2.4 16S rDNA 核苷酸序列分析 將PCR 檢測陽性樣品產(chǎn)物，用膠回收試劑盒進(jìn)行DNA 回收后，送昆明擎科生物公司測序；采用MEGA 11 軟件，對16S rDNA 進(jìn)行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原核酸檢測

在采集的鼻腔黏液以及肺、氣管等組織樣品中檢出ORT 核酸陽性，而ILTV、AIV 和ICV 均為陰性（圖1）。

2.2 16S rDNA 基因序列分析

通過BLAST 比較后，自GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載國內(nèi)外公開的ORT 16S rDNA 基因序列和同源性高的ORT 16S rDNA 基因序列，采用MEGA 11軟件進(jìn)行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。ORT 陽性樣品16S rDNA 基因與ORT14/16株、CH-P940508株的同源性均為99.9%，與土耳其/匈牙利1997株、土耳其/匈牙利2009株及ESV60、ESV207株的同源性均為99.7%（圖2）。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示：ORT 陽性樣品16S rDNA 基因與ORT14/16株、CH-P940508株、土耳其/匈牙利1997株和土耳其/匈牙利2009株在同一個分支內(nèi)，均屬于基因群I型（圖3）。

3 討論

禽鼻氣管鳥桿菌病在全球范圍內(nèi)流行，目前呈快速蔓延趨勢[7]。其易感動物種類繁多，尤以禽類最為易感，禽類感染后主要表現(xiàn)流鼻涕、呼吸紊亂等呼吸道癥狀，以及生長遲緩、采食量及肉增重減少、蛋雞產(chǎn)蛋量降低等。在本研究案例中，臨床剖檢發(fā)現(xiàn)病雞的肺、氣管均出現(xiàn)腫脹、充血以及鼻腔黏液增多等明顯炎癥情況，與文獻(xiàn)[8-10]報道的該病病理變化多見氣囊炎、單側(cè)或雙側(cè)纖維素性化膿性肺炎、胸膜炎等一致。目前，ORT 的病原學(xué)及其感染的防控技術(shù)等研究還不夠深入。由于ORT 血清型眾多，且常與其他細(xì)菌或病毒發(fā)生混合感染，因此有必要深入研究ORT 的致病機理，進(jìn)一步探究該病的防治策略。

全長16S rDNA 核苷酸同源性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系顯示，本次從云南省檢出的ORT 陽性樣品與6株英國分離株LMG 的同源性相差較大，但與伊朗分離株（ORT8/15、ORT14/16）和土耳其/匈牙利分離株（OR006/turkey/Hungary/2009、OR035/turkey/Hungary/1997）的同源性均在99.7%以上，都處于同一分支內(nèi)，與李富祥等[11]2014 年報道的情況一致，說明云南省雞源ORT 在過去8 年內(nèi)突變較少。

ORT 單獨感染時危害不大，死亡率也不高，臨床癥狀較輕微，容易被養(yǎng)殖者忽視，導(dǎo)致后期發(fā)生混合感染，病程延長，用藥治療效果差，危害加大。目前國內(nèi)對ORT 重視程度有待加強，病原研究不夠充分，也沒有相應(yīng)疫苗可用，建議做好生物安全措施，減少各類應(yīng)激，加強飼養(yǎng)管理，防止家禽發(fā)病，從而減少經(jīng)濟損失。云南省是全國重要的養(yǎng)雞大省，2021 年全省出欄肉雞3 億只以上，絕大部分為大型集約化養(yǎng)殖，規(guī)模化養(yǎng)雞場的ORT 檢出率為20%[7]，推算全省約有6 000 萬只雞感染，一旦發(fā)病，可能造成難以估量的經(jīng)濟損失。故建議家禽養(yǎng)殖企業(yè)在重視傳染性和致死性巨大的禽流感、新城疫、馬立克氏病等病毒病的同時，重視細(xì)菌病給生產(chǎn)帶來的影響。