基于CD157的四色法流式細胞術單核細胞和中性粒細胞PNH克隆檢測方法的建立及評價

洪 俊，饒永彩

（1.武漢大學人民醫院檢驗科，湖北 武漢 430060；2.武漢生物制品所，湖北 武漢 430060）

陣發性睡眠性血紅蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一種罕見的獲得性造血干細胞疾病，由X連鎖磷脂酰肌醇聚糖A類（phosphatidylinositol glycan-class A，PIG-A）基因的體細胞突變引起；該突變導致部分或完全不能生物合成糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol，GPI）錨定蛋白；PNH的臨床特征主要有血管內溶血、骨髓發育不良和異常部位形成血栓風險升高[1-2]。1996年以來，流式細胞術已成為檢測GPI缺陷細胞的首選方法[3]。2010年，國際臨床細胞計量學會發布了第1個通過流式細胞儀診斷和監測PNH的指南[4]，Sutherland等于2012年發表了后續實用指南[5]，闡述了PNH中性粒細胞和單核細胞高靈敏度檢測的詳細方案和分析策略，PNH中性粒細胞和單核細胞測定均采用基于熒光Aerolysin的方法——FLAER法。FLAER是Alexa-488標記的無活性氣單胞菌溶素前體的變異體，可以直接結合白細胞上所有GPI連接結構的GPI部分，大量研究結果表明，FLAER法是檢測PNH和相關疾病中GPI缺陷白細胞最為可靠的方法[4-6]。

腺苷二磷酸-核糖基環化酶2（CD157）是由骨髓基質細胞抗原-1基因編碼的GPI錨定細胞表面酶。有研究結果表明，CD157可能具備與FLAER類似的潛在PNH克隆檢測性能[11-12]。由于FLAER非常稀少，且價格昂貴，如何采用流式細胞儀快速、經濟地檢測PNH中性粒細胞和單核細胞PNH克隆，是當前困擾流式細胞術PNH檢測更廣泛開展的一個難題。目前，四色流式細胞術在我國的使用最廣泛，建立可與FLAER法媲美的非FLAER四色法流式細胞術PNH克隆檢測法，顯然對于我國PNH克隆檢測具有更現實的意義。本研究基于CD157、CD14、CD33、CD15、CD24建立非FLAER法的PNH四色流式測定方案（簡稱CD157流式法），并驗證CD157用于PNH克隆檢測的可行性，以尋找FLAER法PNH克隆檢測的替代方法。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2014年1月—2018年9月武漢大學人民醫院45例PNH患者外周血樣本，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）稀釋，獲得中性粒細胞和單核細胞大克隆（＞40%）、中等克隆（1%～40%）、小克隆（＜1%）的PNH克隆。PNH診斷標準參照文獻[1]。因目前PNH相關指南和專家共識中均沒有將PNH基因檢測結果納入PNH診斷依據，所以本研究中的病例均未進行相關基因檢測。本研究經武漢大學倫理委員會批準。

1.2 流式細胞術檢測

流式細胞術檢測樣本處理具體方法參考文獻[8]，將100 μL充分混合的乙二胺四乙酸抗凝外周血與適量預滴定的MoAb在室溫下避光孵育30 min。室溫避光條件下，用2 mL稀釋至1×的新鮮氯化銨溶液裂解紅細胞10 min，然后采用含1%牛血清白蛋白的PBS洗滌白細胞2次，在獲得之前重懸于0.5～1.0 mL PBS。采用FACS Canto Ⅱ流式細胞儀（美國BD公司）及配套試劑進行檢測，數據分析采用FACS-Diva軟件。檢測前，對于初始設置和光電倍增管進行優化，使用在不改變光電倍增管的情況下獲得的單染色補償管生成計算機輔助補償矩陣。使用CST校準微球校準流式細胞儀的電壓及增益。每個樣品測定管至少取200 000個細胞。采用Boolean設門策略分析白細胞，CD157流式法用FSC/SSC、CD45、CD15、CD157和CD24分析中性粒細胞PNH克隆，用FSC/SSC、CD45、CD33、CD157和CD14分析單核細胞PNH克隆；CD55/CD59流式法用FSC / SSC、CD45 、CD55、CD59和CD24用于分析中性粒細胞PNH克隆，使用FSC / SSC，CD45、CD55、CD59和CD14用于分析單核細胞PNH克隆；FLAER法參照文獻[15]進行操作。采用FACS Canto Ⅱ流式細胞儀檢測以下熒光標記單克隆抗體組合：CD14-APC-cy7、CD33-APC、CD157-FITC、CD15-APC、CD24-PE、CD45-PECy7、FLAER-Alexa 488（Cedarlane）、CD24-PE、CD15-PECy5、CD45-PECy7、CD14-PE、CD64-PECy5和CD45-PECy7，每個樣本重復測定3次，取均值。

1.3 CD157流式法精密度評估

1.3.1 批內精密度 對中性粒細胞和單核細胞PNH大、中、小克隆連續重復測定3次，計算、s和變異系數（coefficient of variation，CV）。

1.3.2 批間精密度 在24 h內對中性粒細胞和單核細胞PNH大、中、小克隆進行10次單獨檢測(儀器斷電、重新校準)，計算、s和CV。

1.4 統計學方法

采用線性回歸和Pearson相關分析評價不同流式檢測方法批內和批間測定結果的相關性，以P＜0.01為差異有統計學意義。采用Wilcoxon秩檢驗進行配對樣本比較，以P＜0.05為差異具有統計學意義。通過Bland-Altman分析評估2種方法檢測性能的一致性，以平均偏差為零表示2種方法絕對性能一致。率的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD157流式法PNH中性粒細胞和單核細胞檢測結果

CD157流式法PNH中性粒細胞和單核細胞檢測結果見圖1。

圖1 CD157流式法中性粒細胞、單核細胞PNH克隆流式散點圖

2.2 批內、批間精密度

（1）批內精密度。對于PNH大克隆，中性粒細胞和單核細胞的CV分別為0.07%、0.28%；對于PNH中等克隆，中性粒細胞，單核細胞的CV分別為0.71%和0.78%；對于PNH小克隆，中性粒細胞和單核細胞的CV分別為3.01%和4.95%。見表1。

表1 批內精密度 %

（2）批間精密度。在24 h內對所有PNH克隆進行連續10次的單獨分析運行測定（儀器斷電和重新校準）。對于PNH大克隆，中性粒細胞和單核細胞的CV分別為0.19%和0.27%；對于PNH中等克隆，中性粒細胞，單核細胞的CV分別為1.30%和2.84%；對于PNH小克隆，中性粒細胞和單核細胞的CV分別為7.19%和7.98%。見表2。

表2 批間精密度 %

2.3 CD157流式法和FLAER法單核細胞、中性粒細胞檢測結果相關性和一致性分析

采用CD157流式法和FLAER法[11-12]對45份PNH患者的外周血樣本進行平行分析。PNH中性粒細胞的線性回歸分析結果顯示，2種方法相關性良好[Y=0.98X-0.058（r2=0.998）]。Wilcoxon秩檢驗結果顯示，2種方法檢測結果差異無統計學意義（P＞0.05）；Bland-Altman分析結果顯示，2種方法的一致性較好（平均偏差為0.13%）。PNH單核細胞的線性回歸分析結果顯示，2種方法相關性良好[Y=0.99X+0.089（r2=0.996）]。Wilcoxon秩檢驗結果顯示，2種方法檢測結果差異無統計學意義（P＞0.05）；Bland-Altman分析結果顯示，2種方法一致性較好（平均偏差為0.07%）。見圖2、表3。

表3 CD157流式法和FLAER法對45份PNH克隆樣本的分析數據 %

圖2 CD157流式法與FLAER法的相關性和一致性分析結果

2.4 3種流式細胞檢測方法診斷PNH的效能

對CD157流式法、FLAER法和CD55/CD59流式法診斷PNH的效能進行比較，結果顯示，CD157流式法和FLAER法診斷PNH的效能優于CD55/CD59流式法。見表4。

表4 3種流式法診斷PNH的效能

3 討論

有研究結果顯示，35%的PNH患者在診斷后5年內因相關并發癥死亡[1]。對骨髓衰竭患者進行早期PNH克隆檢測可能會影響治療決策和結果，出現PNH微小克隆通常預示患者對免疫抑制療法反應良好[2]。因此，有效檢測GPI缺陷細胞是診斷PNH和治療骨髓衰竭的關鍵。

SUTHERLAND等[5]制定了利用特定試劑測定PNH的標準化程序，以及PNH中性粒細胞和單核細胞高靈敏度檢測的詳細方案和分析策略。該方案基于熒光Aerolysin（FLAER）的方法，包括針對中性粒細胞的FLAERAlexa488、CD24-PE、CD15-PECy5、CD45-PECy7和針對單核細胞的FLAERAlexa488、CD14-PE、CD64-PECy5、CD45-PECy7。有多中心研究結果顯示，基于2管/四色流式細胞檢測中性粒細胞和單核細胞PNH克隆的FLAER法是通過流式細胞術驗證和標準化PNH測定的良好基礎[7-9]。毫無疑問，FLAER法是GPI缺陷型中性粒細胞和單核細胞的高靈敏度檢測方法[4-9，11-14]。然而，作為近年來新開發的流式細胞檢測非單克隆抗體試劑，FLAER的產量非常少，目前全球僅1家公司生產，且價格高昂。因此，如何采用流式細胞儀快速和經濟地檢測中性粒細胞和單核細胞PNH克隆，是當前PNH流式細胞術檢測更廣泛開展面臨的難題。

CD157是由骨髓基質細胞抗原-1基因編碼的GPI錨定細胞表面酶，主要在前B細胞生長中發揮作用[10]。在造血系統內，CD157在正常中性粒細胞和單核細胞上高表達[15]。有研究結果表明，CD157可能具備與FLAER類似的潛在PNH克隆檢測性能[11-12]。本研究參考相關指南[4-5，13-14]，使用CD24、CD15、CD45、CD157（中性粒細胞）和CD14、CD33、CD157（單核細胞）建立了基于CD157的非FLAER法流式細胞術PNH檢測方案，并與經典的FLAER法進行了比較。結果顯示，CD157流式法與FLAER法中性粒細胞、單核細胞PNH克隆的檢測結果差異均無統計學意義（P＞0.05）；2種方法的相關性良好（r2＞0.99），一致性良好（中性粒細胞和單核細胞PNH克隆的平均偏差分別為0.13%、0.07%）；CD157流式法的批內和批間精密度分別低于5%和8%，檢測單核細胞PNH克隆的批內、批間精密度均高于檢測中性粒細胞PNH克隆；這可能與單核細胞數量較少，獲得性事件顯著少于中性粒細胞而具有更多的異質性結果有關。本研究還發現，CD157流式法和FLAER法診斷PNH的敏感性均為100%，高于CD55/CD59流式法（94.0%）。

綜上所述，基于CD157的中性粒細胞和單核細胞PNH克隆檢測方法具有良好的檢測性能，CD157流式法檢測結果與FLAER法一致性良好，基于CD157的非FLAER法可以作為無法使用FLAER法的實驗室進行PNH克隆檢測的替代方案。