血清HER-2、CD44聯合檢測在結直腸癌中的臨床價值

陳 思，劉 華，劉鷖雯，何怡青，張國良，楊翠霞，杜 艷，高 鋒

（1.上海交通大學附屬第六人民醫院檢驗科，上海 200233；2.上海交通大學附屬第六人民醫院中心實驗室，上海 200233）

結直腸癌是居全球第2位的癌癥相關死亡原因，約有20%的患者在確診時已發生轉移，有近30%的患者會發生復發[1]。近年來，我國結直腸癌發病率及死亡率也呈現明顯上升趨勢[2]。盡管血清腫瘤標志物，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）19-9已廣泛用于結直腸癌的篩查，但二者的敏感性均較低。另外，結腸鏡檢查屬于有創檢查，患者依從性較差；糞便隱血試驗的影響因素較多，敏感性也較低。因此，目前的臨床篩查方法可能會導致結直腸癌患者確診及治療的滯后[3]。臨床迫切需要可有效用于結直腸癌診斷、預后評估和療效監測的新的無創性生物標志物。人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）的異常表達與乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的進展相關。有研究結果顯示，約有6%的結直腸癌患者存在HER-2過表達。分化抗原簇44（cluster of differentiation 44，CD44）是經典的腫瘤干細胞標志物。值得關注的是，CD44是HER-2的共受體，二者之間存在緊密的二硫鍵連接[4-5]。HER-2與CD44均位于細胞表面，但在選擇性剪接或蛋白酶消化的情況下可進入血液循環。有研究發現，HER-2、CD44有望成為結直腸癌的血清學標志物[6-7]，但與傳統血清學指標CEA、CA19-9相比，其臨床應用前景尚不明確，血清HER-2及CD44水平與結直腸癌患者臨床病理特征的相關性，及其對結直腸癌的預后評估價值也未達成共識。另外，HER-2與CD44作為共受體，二者的聯合檢測在結直腸癌的臨床應用中是否具有協同互補的優勢的研究尚未見報道。為此，本研究擬探討結直腸癌患者血清HER-2及CD44水平及二者之間的相關性，以期為結直腸癌的輔助診斷及術后療效監測提供新的生物學標志物。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2021年6—9月上海交通大學附屬第六人民醫院經病理檢查確診的結直腸癌患者38例（結直腸癌組），其中男24例、女14例，年齡47～75歲，包括結腸癌18例、直腸癌20例。納入標準：（1）術后病理學診斷為原發性結直腸腺癌；（2）術前未行放化療；（3）優先納入能夠獲取術前、術后配對血清的患者。排除標準：（1）結直腸原位癌、鱗癌、腺鱗癌；（2）轉移性結直腸癌、復發性惡性腫瘤；（3）伴有其他部位、其他類型的原發惡性腫瘤。選取同期上海交通大學附屬第六人民醫院結直腸良性病變患者35例（良性病變組），其中男24例、女11例，年齡40～74歲，包括結腸炎7例、克羅恩病1例、潰瘍性結腸炎4例、腺瘤23例。另選取同期上海交通大學附屬第六人民醫院健康體檢者36名作為正常對照組，其中男26名、女10名，年齡50～72歲，血壓、血脂、血糖、肝功能和腎功能等均正常。本研究經上海交通大學附屬第六人民醫院倫理委員會批準，所有研究對象或其家屬均知情同意。

1.2 方法

收集所有對象的臨床一般資料，包括年齡、性別、腫瘤類型、腫瘤大小、TNM分期、是否有淋巴結轉移、是否有神經侵犯、是否有脈管侵犯、Ras基因型和CEA、CA19-9檢測結果等，其中有5例患者的腫瘤大小未知，1例患者TNM分期未知，4例患者淋巴結轉移、神經侵犯、脈管侵犯情況不明，13例結直腸癌患者的Ras基因型病理信息缺失。

采用分離膠促凝管采集結直腸癌患者術前、術后2～3 d和正常對照者、結直腸良性病變患者的空腹靜脈血2 mL，離心分離血清，轉移至滅菌Eppendorf管中，保存于-80 ℃冰箱，統一采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清HER-2及CD44水平，試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。人可溶性CD44分子（sCD44）ELISA試劑盒的最低檢測限為10 pg/mL，線性范圍為100～3 200 pg/mL，批間和批內變異系數（coefficient of variation，CV）均＜15%，標準曲線r2=0.981。人表皮生長因子受體2（sp185，H E R-2）E L I S A試劑盒的最低檢測限為0.1 ng/mL，線性范圍0.5～16 ng/mL，批間CV＜15%，批內CV＜10%，標準曲線r2=0.997。檢測儀器為Epoch酶標儀（美國BioTek公司）。嚴格按儀器和試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件和Graphpad Prism 7軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料采用±s表示，2個組之間比較采用t檢驗或配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。呈偏態分布的計量資料以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗。兩變量的相關分析采用Pearson線性相關分析，兩變量的回歸分析采用線性回歸分析。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估各項指標輔助診斷結直腸癌的效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組、良性病變組及正常對照組血清HER-2及CD44水平的比較

結直腸癌組術前血清HER-2水平均高于良性病變組和正常對照組（P＜0.05、P＜0.000 1）。結直腸癌組術前血清CD44水平高于正常對照組（P＜0.05），與良性病變組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組之間血清HER-2和CD44水平的比較

2.2 血清HER-2和CD44水平與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

Ras基因突變型及有周圍神經侵犯的結直腸癌患者血清HER-2水平分別高于Ras基因野生型及無周圍神經侵犯的患者（P＜0.05），而CD44水平差異無統計學意義（P＞0.05）。不同年齡、性別、腫瘤類型、腫瘤大小、TNM分期以及有、無淋巴結轉移和脈管侵犯的結直腸癌患者之間血清HER-2及CD44水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 血清HER-2和CD44水平與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

2.3 血清HER-2和CD44相關性分析

結直腸癌患者術前血清HER-2與CD44水平呈正相關，相關方程為：Y=0.7696X+1.515（r=0.50，P＜0.01）。見圖1。

圖1 結直腸癌患者術前血清HER-2與CD44水平的相關性

2.4 血清HER-2和CD44輔助診斷結直腸癌的效能

（1）以正常對照組為對照，建立血清HER-2、CD44、CEA、CA19-9聯合檢測的Logistic回歸模型，方程為：Logit（P）=-3.901+0.700×HER-2+0.711×CD44+0.055×CEA+0.079×CA19-9。HER-2、CD44、CEA、CA19-9單項檢測及聯合檢測輔助診斷結直腸癌的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.779、0.692、0.620、0.634及0.837，敏感性分別為84.2%、55.3%、63.2%、44.7%及76.3%，特異性分別為66.7%、77.8%、61.1%、100.0%及80.6%。見表3。

表3 以正常對照組為對照時各項指標單項和聯合檢測輔助診斷結直腸癌的ROC曲線參數

（2）以良性病變組為對照，建立血清HER-2、CD44、CEA、CA19-9聯合檢測的Logistic回歸模型，方程為：Logit（P）=-0.584-0.135×HER-2-0.017×CD44+0.069×CEA+0.055×CA19-9。HER-2、CD44、CEA、CA19-9單項檢測及聯合檢測鑒別診斷結直腸癌的AUC分別為0.471、0.534、0.677、0.645及0.723，敏感性分別為81.6%、97.4%、63.2%、63.2%及60.5%，特異性分別為29.4%、23.5%、67.6%、70.6%及79.4%。見表4。

表4 以良性病變組為對照時各項指標單項和聯合檢測鑒別診斷結直腸癌的ROC曲線參數

2.5 30例結直腸癌患者術前、術后血清HER-2、CD44、CEA、CA19-9水平的比較

結直腸癌患者術后血清CD44、CEA、CA19-9水平均顯著低于術前（P＜0.000 1、P＜0.000 1、P＜0.01），而血清HER-2水平術前、術后差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5、圖2。

圖2 30例結直腸癌患者術前、術后血清HER-2、CD44、CEA、CA19-9水平變化

表5 30例結直腸癌患者術前、術后血清HER-2、CD44、CEA、CA19-9水平的比較

3 討論

HER-2是人表皮生長因子受體家族成員之一，在抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤細胞增殖及腫瘤血管生成等方面發揮重要作用。作為HER-2的共受體，CD44是公認的結直腸癌腫瘤干細胞標志物。既往研究多關注結直腸癌組織中HER-2和CD44的表達水平及臨床意義，而關于血清HER-2和CD44聯合檢測的臨床應用鮮有報道。本研究發現，結直腸癌患者HER-2與CD44呈正相關（r=0.50，P＜0.01）。由于CD44和HER-2在結構和功能上均存在緊密聯系，我們認為二者在結直腸癌的發生、發展過程中可能發揮協同效應。因此，血清HER-2和CD44的聯合應用在結直腸癌的輔助診斷及療效監測中可能具有協同互補的優勢。

本研究結果顯示，結直腸癌組術前血清HER-2水平均明顯高于良性對照組和正常對照組（P＜0.05、P＜0.000 1）。提示血清HER-2在結直腸癌的輔助診斷和鑒別診斷中具有較大價值。本研究發現，結直腸癌患者術前血清CD44水平明顯高于正常對照組（P＜0.05），與良性病變組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。提示血清CD44在結直腸癌診斷及鑒別診斷中的特異性較低，有必要與其他腫瘤標志物聯合應用。本研究ROC曲線分析結果顯示，以正常對照組為對照，HER-2、CD44、CEA、CA19-9單項檢測及聯合檢測輔助診斷結直腸癌的AUC分別為0.779、0.692、0.620、0.634及0.837，敏感性分別為84.2%、55.3%、63.2%、44.7%及76.3%，特異性分別為66.7%、77.8%、61.1%、100.0%及80.6%，相對于CEA和CA19-9，血清HER-2輔助診斷結直腸癌的敏感性更高；以良性病變組為對照，HER-2、CD44、CEA、CA19-9單項檢測及聯合檢測鑒別診斷結直腸癌的AUC分別為0.471、0.534、0.677、0.645及0.723，敏感性分別為81.6%、97.4%、63.2%、63.2%及60.5%，特異性分別為29.4%、23.5%、67.6%、70.6%及79.4%，血清HER-2、CD44鑒別診斷結直腸癌的敏感性均高于CEA、CA19-9。由此可見，血清HER-2、CD44的優勢在于具有較高的敏感性，可彌補CEA和CA19-9敏感性低的不足。本研究結果提示，4項指標聯合檢測的診斷效能顯著優于單項指標，可明顯提高結直腸癌診斷的敏感性。因此，血清HER-2和CD44與傳統腫瘤標志物聯合應用或可提高結直腸癌的檢出率。

復發是影響結直腸癌患者預后的關鍵因素，術后監測對于結直腸癌患者至關重要。本研究發現，與CEA、CA19-9的變化情況類似，結直腸癌患者術后2～3 d血清CD44水平顯著降低，表明血清CD44可能來源于腫瘤組織，其水平變化可以反映結直腸癌患者的手術效果。GUO等[8]的研究結果顯示，化療也會使結直腸癌患者血清CD44水平降低。因此，血清CD44可能具有動態監測結直腸癌患者療效的價值。此外，本研究結果顯示，結直腸癌患者術前、術后血清HER-2水平差異無統計學意義（P＞0.05）。TSIGRIS等[9]的研究結果顯示，結直腸癌患者術后7 d血清HER-2水平明顯降低。這可能與血清HER-2的半衰期較長有關。因此，與CD44相比，結直腸癌患者術后血清HER-2水平下降可能相對滯后，進一步提示二者在結直腸癌中的臨床價值具有協同互補的特點。總之，聯合檢測血清HER-2及 CD44可能在結直腸癌患者的療效監測中發揮重要作用，后續研究將進一步探索其在監測結直腸癌患者復發中的潛在價值。

本研究結果還顯示，結直腸癌患者血清HER-2水平與Ras基因突變及周圍神經侵犯相關。Ras基因的突變狀態是臨床判斷結直腸癌患者是否適合表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）靶向治療的預測因子，HER-2是EGFR家族成員之一。本研究結果顯示，發生Ras基因突變的結直腸癌患者血清HER-2水平顯著升高，提示血清HER-2可作為臨床制定治療方案的參考指標。美國國立綜合癌癥網絡（the National Comprehensive Cancer Network，NCCN）將周圍神經侵犯作為Ⅱ期結直腸癌患者的高危因素，提示此類患者更易發生腫瘤侵犯和轉移。有多項研究結果表明，宮頸腺癌及壺腹周圍癌患者HER-2過表達與周圍神經侵犯相關[10-12]。本研究發現，有周圍神經侵犯的結直腸癌患者血清HER-2水平顯著升高，提示血清HER-2水平在一定程度上可反映腫瘤的侵襲狀況，檢測HER-2水平有助于判斷結直腸癌患者的病程進展和預后。本研究的不足之處在于樣本量較小，為了觀察術后血清學相關指標的變化，本研究側重要求納入的結直腸癌患者術前、術后血清樣本的配對性，導致入選病例較少，后續將進一步擴大樣本量，并進行跟蹤研究。

綜上所述，HER-2與CD44在結構和功能上存在緊密聯系，且在結直腸癌輔助診斷及療效監測中展現出明顯的相關性和互補性，提示血清HER-2及CD44聯合檢測在結直腸癌中具有重要的臨床價值。