選擇性ER調節劑對骨肉瘤細胞增殖及CCL2表達的抑制作用研究

孫小丹，許 靜，劉鷖雯，何怡青，杜 艷，張國良，高 鋒，楊翠霞

（1.上海交通大學附屬第六人民醫院檢驗科，上海 200233；2.上海交通大學附屬第六人民醫院中心實驗室，上海 200233）

骨肉瘤是一種罕見的間充質惡性腫瘤，具有較強的侵襲、轉移能力，有80%～90%的患者在首次確診時即伴有潛在轉移灶[1]。單純手術截肢治療的患者5年生存率低于20%[2]。化療可顯著提高患者的預期壽命，目前臨床上多采用手術切除和聯合化療的治療方案治療骨肉瘤肺轉移患者[3]。然而，大劑量的化療藥物副作用較多，已成為影響治療效果及預后的關鍵因素[4]。雌激素受體（estrogen receptor，ER）與腫瘤細胞的生長、耐藥及轉移能力均密切相關[5]。除性激素依賴的靶器官腫瘤外，ER還表達于胃癌、結腸癌、肺癌及骨腫瘤等惡性腫瘤中[6]。有研究結果顯示，調控ER的表達水平或活性可有效改變雌激素/ER依賴的轉錄因子表達[7]，進而影響腫瘤的藥物敏感性、生長特性等。目前，臨床上針對ER的選擇性ER調節劑有他莫昔芬、雷洛昔芬、巴多昔芬等，其中他莫昔芬可作為化療增敏劑，增強ER陽性腫瘤患者對化療藥物的敏感性[8]；巴多昔芬可抑制結腸癌細胞中炎癥因子的表達，進而抑制結腸癌細胞的增殖，逆轉耐藥性[9]。目前，針對選擇性ER調節劑是否可有效抑制骨肉瘤細胞的增殖及腫瘤進展、調控骨肉瘤細胞炎癥因子釋放的研究較少。為此，本研究擬探討骨肉瘤細胞中ER的表達量及選擇性ER調節劑他莫昔芬對骨肉瘤細胞增殖和炎癥因子表達的影響，同時分析他莫昔芬對骨肉瘤細胞CC趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）2表達的影響，為選擇性ER調節劑在骨肉瘤治療中的應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 細胞培養

人成骨細胞系hFOB1.19和人骨肉瘤細胞系143B購自美國典型培養物保藏中心，人骨肉瘤細胞系U-2OS購自中國科學院細胞庫。hFOB1.19細胞采用含10%胎牛血清、0.3 mg/mL G418、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM），在33.5 ℃、5% CO2環境中培養。143B細胞和U-2OS細胞均采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM，在37 ℃、5% CO2環境中培養。細胞密度為70%時進行后續實驗。

1.2 細胞增殖實驗

采用CCK-8法分別檢測加入10 μmol/L二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO；上海澤邁生物技術有限公司）（DMSO組）、10 μmol/L 17β-雌二醇（estradiol，E2；美國MedChem Express公司）（E2組）和10 μmol/L他莫昔芬（美國MedChem Express公司）（他莫昔芬組）48 h后的細胞存活情況，CCK-8試劑盒購自美國Promega公司。將143B細胞或U-2OS細胞按3 000個/孔接種到96孔板中，培養24 h后分別加入10 μmol/L他莫昔芬和10 μmol/L E2，培養48 h后，每孔加入20 μL CCK-8試劑，37 °C孵育2 h。采用Epoch酶標儀（美國BioTek公司）檢測吸光度（A）值。

1.3 平板克隆形成實驗

將143B細胞和U-2OS細胞以800 個/孔接種于6孔板中，加入10 μmol/L DMSO（DMSO組）、10 μmol/L E2（E2組）和10 μmol/L他莫昔芬（他莫昔芬組），培養2周，直到形成肉眼可見的克隆后，采用4%多聚甲醛固定液固定細胞20 min；去除固定液，用1×磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）洗滌3次，再用 0.05%結晶紫溶液染色20 min，使用 1×PBS 洗滌后風干。拍照并記錄所形成的細胞克隆數目。

1.4 免疫印跡法

采用RIPA裂解液（上海碧云天公司）裂解細胞，收集細胞裂解物上清液，提取總蛋白。采用蛋白定量試劑盒（美國Sigma公司）測定總蛋白濃度。吸取10 μg蛋白，加入蛋白上樣緩沖液（上海碧云天公司），置于100 ℃水浴鍋孵育10 min。采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，通過濕轉法轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，然后用含5%脫脂奶粉的三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液（tris-hydroxymethyl aminomethane-Tween，TBST）封閉1 h，加入一抗，4 °C下孵育過夜。一抗為磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，pPKB；又稱pAkt ）308抗體（貨號13038T）、pAkt473抗體（貨號4060T）、細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）抗體（貨號4695）和磷酸化細胞外調節蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinase，pERK）抗體（貨號4370P），均購自美國Cell Signaling Technology公司。用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的多克隆二抗（杭州聯科生物公司）孵育1 h。加入化學發光底物，采用Amersham Imager 600掃描成像系統（美國GE healthcare Bio-Sciences AB公司）分析。以3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參，使用Image Pro-Plus 6.0軟件（美國 Media Cybernetics 公司）對圖像灰度進行分析。

1.5 熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）

將30 000個143B細胞接種到6孔板中，培養24 h后分別加入10 μmol/L他莫昔芬和10 μmol/L E2，培養48 h。采用RNAiso Plus（日本TaKaRa公司）從143B細胞中提取總RNA。采用NanoDrop系統（美國ThermoFisher Scientific公司）測定RNA濃度。采用含gDNA Eraser（日本TaKaRa公司）的PrimeScript T Reagent試劑盒逆轉錄1 μg mRNA。采用熒光定量PCR檢測IL-6、IL-8、TGF-β、CCL2和CCL5基因表達，SYBR試劑盒購自日本TaKaRa公司，檢測儀器為QuantStudio 7 Flex實時熒光定量PCR儀（美國ThermoFisher Scientific公司）。引物由上海擎科生物有限公司合成，引物序列見表1。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.6 細胞上清的收集及CCL2水平檢測

將143B細胞和U-2OS細胞分別接種于24孔板中，加入500 μL培養液，再分別加入10 μmol/L E2（E2組）和10 μmol/L 他莫昔芬（他莫昔芬組），處理3 d，設相應的空白對照（DMSO組）。收集培養上清，離心去除細胞沉淀，保存于-20 ℃冰箱。采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測143B細胞和U-2OS細胞培養上清中的CCL2水平。試劑盒購自上海森雄有限公司，最低檢測限為63 pg/mL，線性范圍125～8 000 pg/mL，批間變異系數＜15%，批內變異系數＜10%，標準曲線r2值為0.999 3。檢測儀器為Epoch酶標儀（美國BioTek公司）。嚴格按儀器和試劑盒說明書操作。

1.7 統計學方法

所有實驗至少獨立重復3次。采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統計分析。呈正態分布的數據多組間比較采用單因素方差分析，2個組之間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨肉瘤細胞和成骨細胞ER mRNA的表達

2種骨肉瘤細胞（143B和U-2OS）的ER mRNA相對表達量均顯著低于成骨細胞（hFOB1.19）。見圖1。

圖1 骨肉瘤細胞（143B和U-2OS）和成骨細胞（hFOB1.19）ER mRNA表達比較

2.2 選擇性ER調節劑他莫昔芬對骨肉瘤細胞生長的抑制作用

143B細胞的CCK-8增殖實驗和平板克隆實驗結果顯示，與DMSO組比較，他莫昔芬組細胞數顯著降低（P＜0.05），E2組細胞數差異無統計學意義（P＞0.05）。U-2OS細胞的CCK-8增殖實驗和平板克隆實驗結果顯示，他莫昔芬組和E2組細胞數均低于DMSO組（P＜0.05）。免疫印跡法結果顯示，與DMSO組比較，他莫昔芬組pAkt和pERK水平顯著降低（P＜0.05），E2組pAkt和pERK水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 選擇性ER調節劑他莫昔芬對骨肉瘤細胞增殖的影響

2.3 選擇性ER調節劑對骨肉瘤細胞143B分泌炎癥因子的抑制作用

他莫昔芬可顯著抑制143B細胞IL-6、IL-8、TGF-β、CXCL1、CCL2和CCL5基因表達，其中對CCL2表達的抑制作用最為顯著。見圖3。

圖3 選擇性ER調節劑對骨肉瘤細胞143B炎癥因子表達的抑制作用

2.4 選擇性ER調節劑他莫昔芬對骨肉瘤細胞（143B和U-2OS）CCL2分泌的抑制作用

他莫昔芬組2種骨肉瘤細胞（143B和U-2OS）CCL2的分泌量顯著低于DMSO組（P＜0.05），而E2組CCL2的分泌量顯著高于DMSO組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 DMSO、E2和他莫昔芬對骨肉瘤細胞（143B和U-2OS）CCL2分泌的影響

3 討論

骨肉瘤是高度異質性的間充質腫瘤，臨床上多采用手術切除及術后化療[1]進行治療，但大劑量使用化療藥物副作用較多[4]，且骨肉瘤患者的5年總體生存率不理想，復發率較高[10]，臨床亟需更好的治療方案。本研究結果顯示，選擇性ER調節劑他莫昔芬可抑制骨肉瘤細胞的增殖及CCL2表達，提示選擇性ER調節劑可作為骨肉瘤切除術后化療的輔助方案，可能對改善骨肉瘤患者的預后及遠期生存率具有積極意義。

骨肉瘤好發于兒童和青少年，此階段正是性激素分泌最活躍的時期。有研究發現，在骨肉瘤組織及細胞中均發現ER呈低表達[11]；另有研究發現，骨肉瘤的發生可能與ER的水平及活性有關[12]。本研究結果顯示，骨肉瘤細胞143B和U-2OS的ER表達量顯著低于成骨細胞hFOB1.19（P＜0.05），與文獻報道[13]一致。

選擇性ER調節劑（他莫昔芬等）目前已被廣泛用于ER陽性乳腺癌的內分泌治療，且療效良好[14]。選擇性ER調節劑可抑制乳腺癌的生長和轉移[15]，而在骨組織、心血管系統中，選擇性ER調節劑則作為ER激動劑發揮作用[16]。本研究結果顯示，E2和他莫昔芬均可抑制骨肉瘤細胞的增殖，且他莫昔芬的抑制作用更強，提示他莫昔芬可作為骨肉瘤化療的輔助方案。

在腫瘤微環境中，炎癥因子可促進腫瘤生長和轉移[17]，并誘導腫瘤細胞的侵襲和耐藥[5]。有研究發現，手術創傷會導致腫瘤患者體內炎癥因子水平升高[18]，升高的炎癥因子在腫瘤的休眠和復發中發揮重要作用[19]。CCL2作為趨化因子家族成員之一，是腫瘤微環境中重要的炎癥因子，可通過誘導腫瘤細胞侵襲和轉移，促進腫瘤的惡性進展[20]。CCL2在多種腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、骨肉瘤中呈異常表達[21]，其表達水平與患者的預后相關。

有研究結果顯示，選擇性ER調節劑可調控炎癥因子的分泌[9]，他莫昔芬可通過直接發揮抗氧化作用來減輕機體氧化應激，從而緩解機體炎癥反應[20]。在子宮肌瘤治療過程中，他莫昔芬聯合米非司酮能顯著降低子宮肌瘤患者的炎癥反應，從而抑制疾病進展[21]。本研究發現，他莫昔芬可顯著抑制骨肉瘤細胞中多種炎癥因子基因的表達，其中對CCL2基因的抑制作用最強。

綜上所述，骨肉瘤細胞ER呈低表達。選擇性ER調節劑他莫昔芬可明顯抑制骨肉瘤細胞的增殖及CCL2的表達，可能對骨肉瘤患者的預后具有積極作用。