基于網絡藥理學與分子對接技術探討黃芪治療鼻炎的作用機制

劉小敏，邱海燕，蘇楊，張樂樂，曹亞楠，陳加容，鄒亮，胡櫻凡

鼻炎（rhinitis）是一種由鼻腔粘膜炎癥引起的上呼吸道疾病，表現為鼻塞、流鼻涕、鼻癢和打噴嚏等癥狀。鼻炎嚴重影響患者的生活質量，包括睡眠、工作效率等，并伴有嚴重的心理障礙，也是發展為哮喘的危險因素[1]。西醫治療鼻炎主要通過化藥和手術等方式，但不良反應較多，需長期服藥，患者順應性差，疼痛感強，傷害鼻腔。近年來，中醫藥在改善鼻炎患者癥狀、提高患者生活質量等方面發揮著重要作用。

中醫理論認為，鼻炎病機多為肺脾虛寒，衛陽不固，風邪趁虛而入所致。黃芪，性甘溫，歸肺、脾經，作為傳統補益藥之一，具有補脾升陽、益氣固表等功效[2]。臨床研究表明，黃芪顆粒[3]、黃芪注射液[4]、黃芪桂枝五物湯[5]、脫敏湯[6]、辛芪顆粒[7]、黃芪建中湯[8]等黃芩復方，均能夠改善鼻炎患者的癥狀，在臨床上取得較好療效。現代藥理研究表明，黃芪有效成分黃芪甲苷可通過下調JAK2/STAT6信號通路及ROS水平[9]，從而達到治療鼻炎的目的；黃芪多糖可通過調節Th1/Th2免疫平衡改善大鼠鼻黏膜炎性癥狀[10]。目前，黃芪干預鼻炎的研究較少，對于黃芪治療鼻炎的藥效物質基礎及作用機制尚不明確。因此本研究采用網絡藥理學與分子對接技術探討黃芪治療鼻炎的潛在藥效物質和分子作用機制，以期進一步為黃芪治療鼻炎的中醫理論和臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 黃芪活性成分及靶點收集

通過TCMSP數據庫（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/ tcmsp.php）檢索黃芪的化學成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選閾值，得到黃芪的活性成分。在TCMSP數據庫檢索活性成分的相關靶點，利用UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）獲得對應的人源靶基因。利用PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）檢索在TCMSP數據庫中無靶點的化合物的Canonical SMILES，通過Swiss Target Prediction數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch）、Similarity ensemble approach數據庫（http://sea.bkslab.org/）、PharmMapper數據庫（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/）對化合物潛在的作用靶點進行預測。

1.2 鼻炎相關靶點收集

在GeneCards數據庫（https://www.genecards.org）中，以“rhinitis”為關鍵詞，檢索與鼻炎相關的靶點。

1.3 黃芪治療鼻炎潛在靶點預測

將黃芪活性成分的相關靶點及鼻炎相關靶點錄入Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），獲取兩者交集，即為黃芪治療鼻炎的潛在作用靶點。

1.4 “活性成分-潛在靶點”網絡構建及可視化分析

將活性成分和潛在靶點錄入Cytoscape 3.7.2（https://cytoscape.org/）軟件，構建黃芪與鼻炎“活性成分-潛在靶點”網絡并進行可視化分析。

1.5 蛋白互作網絡（PPI）的構建

將潛在靶點輸入STRING數據庫（http://stringdb.org/cgi/input.pl）構建黃芪抗鼻炎的蛋白互作網絡（PPI）。定義物種為人，將最低互作評分下的“high confidence”設定為0.9，同時隱藏游離的節點。使用R軟件，得到前30名蛋白及節點連接數量的柱狀圖，連接數量的大小可直接代表節點在網絡中的地位。

1.6 GO功能富集和KEGG通路分析

使用Bioconductor數據庫（http://www.bioconductor.org/）、R軟件及其下屬包“clusterProfiler”對關鍵靶點進行GO功能富集分析（BP、CC、MF）和KEGG通路分析。選取P-value靠前的分析結果進行相應的可視化處理。

1.7 “通路-關鍵靶點”網絡構建

運用Cytoscape 3.7.2軟件對KEGG通路富集分析中得到的通路與整合的蛋白靶點構建“通路-關鍵靶點”網絡。

1.8 分子對接

采用Vina軟件對主要活性成分及關鍵靶點進行分子對接，驗證網絡藥理學分析預測的可靠性。在PubChem數據庫檢索主要活性成分2D分子結構的SDF文件，使用ChemOffice軟件進行優化，獲得3D分子結構，保存為*.mol2格式。在PDB數據庫（http://www.rcsb.org/）中下載關鍵靶點的三維結構，使用PyMOL軟件刪除靶點配體，保存為pdb格式。運用AutoDock Tools軟件對大分子蛋白進行加氫，計算Gasteiger電荷，保存為pdbqt格式。設置相關參數，運用AutoDock Vina軟件將化合物配體和靶蛋白受體對接，并使用PyMOL軟件對對接結果進行可視化分析。

2 結果

2.1 黃芪治療鼻炎的活性成分及靶點的獲取

從TCMSP數據庫中共檢索到黃芪相關成分87個，以DL≥0.18和OB≥30%為條件篩選，共獲得21個活性成分（表1），通過TCMSP數據庫檢索活性成分所涉及的靶點并在Pubchem數據庫中檢索在TCMSP數據庫中無靶點的化合物的Canonical SMILES，通過Swiss Target Prediction、Similarity ensemble approach、PharmMapper數據庫對化合物潛在的作用靶點進行預測，經UniProt數據庫篩選校正后，共獲得339個靶點。

表1 黃芪治療鼻炎潛在成分

2.2 鼻炎相關靶點收集

以“rhinitis”為檢索詞，從Genecards數據庫中檢索到2638個與鼻炎相關的靶點。將黃芪活性成分的339個靶點與鼻炎的2638個靶點取交集后，共獲得147個交集靶點，對應16個活性成分。

2.3 “活性成分-潛在靶點”網絡的構建

將16個活性成分與147個交集靶點錄入Cytoscape 3.7.2軟件繪制“活性成分-潛在靶點”調控網絡（圖2），紅色三角形代表活性成分，藍色方塊代表靶點，每條邊代表活性成分與作用靶點之間的關系。圖中共包含163個節點，280條邊。結果顯示主要活性成分有槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、芒柄花黃素（Formononetin）、異鼠李素（Isorhamnetin）、毛蕊異黃酮（Calycosin）、黃芪甲苷（Astragaloside Ⅳ）等，推測其可能是黃芪發揮治療鼻炎作用的主要活性物質，體現了黃芪治療鼻炎多成分、多靶點的特點。

2.4 蛋白互作網絡（PPI）構建

將147個交集靶點輸入STRING數據庫構建聯系緊密的PPI網絡（圖3），圓形節點表示不同的基因蛋白，節點連線代表蛋白之間的相互關系。圖中包含147個節點、1366條連線，連接數量的大小可直接代表節點在網絡中的地位。利用R軟件對靶點間的連線進行計數，繪制連接數目處于前30的柱狀圖（圖4）。結果顯示TP53、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA、JUN等處于核心地位，可能是黃芪治療鼻炎的關鍵靶點。

2.5 靶點的GO富集分析和KEGG通路分析

使用R軟件和Bioconductor加載包，以P≤0.05對147個交集靶點進行GO富集分析，選擇排名前20的結果進行可視化處理（圖5）。其中，生物過程（biological process）共富集到2385條，主要涉及脂多糖反應、活性氧響應、氧化應激反應、細胞外刺激反應、固有凋亡信號通路調控等。細胞組分（cellular component）共富集到75條，主要涉及細胞膜筏、胞質、泛素連接復合物等。分子功能（molecular function）共富集到140條，主要涉及細胞因子、受體、蛋白激酶活性等。體現了黃芪可能通過調控多個GO功能來治療鼻炎。

KEGG通路富集分析共得到166條相關通路（P<0.001），選擇排名前20的結果（表2）進行可視化分析（圖6、圖7），可知基因主要集中在流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、人類巨細胞病毒感染信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路和IL-17信號通路等通路上。以上KEGG富集分析結果表明黃芪可通過調節不同類型的信號通路發揮治療鼻炎的作用。

表2 黃芪治療鼻炎的通路

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2.6 分子對接分析

根據網絡分析結果，選擇槲皮素、山奈酚、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮、異鼠李素5個主要活性成分與TP53、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA 5個關鍵靶點進行分子對接。對接效果表現為結合能，結合能小于0表示配體與受體可自發結合，且結合構象越穩定，結合能越低，結合能< -5.0 kcal﹒mol-1表明具有良好的結合活性，當結合能< -7.0 kcal﹒mol-1時，有強的結合活性。結果顯示（表3），主要活性成分與靶點的結合能均小于-5.0 kcal﹒mol-1，表明通過網絡藥理學篩選得到的活性成分和靶點具有良好的結合活性，預測結果較為可靠。

表3 黃芪中活性成分與靶點的結合能

為明確靶點蛋白與對應活性成分之間的結合活性，選擇6個對接能量較小的結果進行展示（圖8）。結果表明，Quercetin與TNF中的ARG-32、ALA-33、ASN-34、HIS-15、LEU-93、GLY-148、GLU-146、PHE-144殘基結合，與TP53中的THR-246、GLN-248、LYS-107殘基結合，與AKT1中的LYS-179、GLY-159、GLY-162、PHE-161殘基結合；Calycosin與TNF中的VAL-150、GLY-148、ALA-33、ARG-32殘基結合；Isorhamnetin與TP53中的LEU-195、ARG-80、ASN-278、ARG-337殘基結合；Kaempferol與AKT1中的ASP-292、LYS-276、SER-7、THR-6殘基結合，可觀察到靶點與活性成分均具有良好的結合位點，并借助氫鍵等分子間作用力，形成較穩定的構象。

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3 討論

鼻炎是一種兒童和成人常見的異質性慢性疾病，在全球范圍內呈上升趨勢，嚴重影響著患者的生活質量，其病機主要是肺脾虛寒?！包S芪，補肺健脾，衛實斂汗，驅風運毒之藥也...”（《本草匯言》），藥用歷史長達2000多年?，F代藥理研究發現，黃芪可有效減輕鼻黏膜炎性癥狀[11-13]，從而發揮治療和預防鼻炎的作用，但具體藥效物質基礎和作用機制仍不明確。本研究運用網絡藥理學及分子對接技術探討黃芪治療鼻炎的主要活性物質及其作用機制，體現了黃芪可“多成分，多靶點，多通路”共同作用治療鼻炎。

從“活性成分-潛在靶點”網絡圖可知，槲皮素、山奈酚、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮、異鼠李素、黃芪甲苷等可能是黃芪治療鼻炎的主要活性成分。研究表明，槲皮素可通過調節Th1/Th2細胞因子平衡[14]、降低總IgE和卵清蛋白特異性IgE水平[15]改善大鼠鼻黏膜炎癥程度，減輕鼻炎癥狀；山奈酚是一種有效的抗炎活性物質，可通過抑制IL-32、TSLP以及caspase-1的活性發揮抗鼻炎作用[16]；毛蕊異黃酮[17]和異鼠李素[18]可抑制TNF‐α、IL-6、ⅠL‐1β等炎癥細胞因子的水平以增強抗炎作用；芒柄花黃素可提高小鼠免疫細胞的吞噬功能及溶菌酶的殺菌活性，提高小鼠的適應性體液免疫功能[19]；黃芪甲苷可通過調節Th1/Th2細胞因子平衡，調節T-bet、GATA-3、Foxp3和RORγt的表達[20]，抑制HMGB1/TLR4/NF‐κB通路減少促炎因子的產生[21]來緩解鼻炎癥狀。PPI網絡分析表明，黃芪治療鼻炎的關鍵靶點有TP53、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA等。研究表明，TP53是鼻炎、哮喘發病過程中的關鍵節點基因[22]；IL-6、TNF‐α作為炎癥細胞因子與鼻炎的發生有著密切聯系[23]；VEGFA可刺激血管內皮細胞增殖，通過促進血管通透性調節鼻粘膜組織的炎癥反應[24]；PI3K/AKT信號通路在鼻炎發病機理中具有重要作用，而AKT是該途徑中的關鍵節點[25]。如上所述，槲皮素、山奈酚、異鼠李素等黃芪中的主要活性成分可能通過作用于TP53、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA等關鍵靶點，發揮改善炎癥反應、增強免疫功能的作用以治療和改善鼻炎。

通過GO功能富集和KEGG通路富集分析發現，黃芪可能通過參與脂多糖反應、氧化應激反應、固有凋亡信號通路調控等生物學過程，在細胞膜筏、胞質等部位，發生酶結合、細胞因子受體結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等分子反應，進而調控流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、人類巨細胞病毒感染信號通路、AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等發揮治療鼻炎的作用。流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路主要與血液流變學有關，較低的血流剪切力易導致動脈硬化形成或斑塊破裂、內皮損傷，較高的血流剪切力有利于維持血管內皮的正常功能，保護血管內膜[26]；在TNF信號通路中，TNF‐α可以使NF‐κB等上調而誘導細胞炎癥的發生，與鼻炎的發生機制有一定的聯系[27,28]；IL-17信號通路在鼻炎的發病機制中起著關鍵作用，IL-17是一種主要由輔助性T細胞等分泌的促炎性細胞因子，在鼻炎患者血清中高度表達[29]；AGE/RAGE信號傳導的引發涉及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶、蛋白激酶C和MAPK的多種細胞內信號通路的激活，以及促進IL-6、TNF‐α等炎癥細胞因子的表達，與鼻炎的發生有著密切的聯系[30]。

分子對接結果顯示黃芪的5個主要活性化合物槲皮素、山奈酚、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮、異鼠李素與TP53、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA5個核心靶點均表現出良好的結合活性，結合位點具有穩定的氫鍵，構象穩定，從而驗證網絡藥理學的篩選結果。

綜上所述，本文采用網絡藥理學和分子對接技術系統地分析了黃芪治療鼻炎的作用機制，證明了黃芪對治療鼻炎具有多成分、多靶點、多通路協同作用的特點，揭示了黃芪中槲皮素、山奈酚、異鼠李素等潛在藥效成分，通過作用于AKT1、TNF、IL-6、TP53、VEGFA等多個靶點，調控流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等，參與炎癥反應、糖脂代謝、氧化應激等發揮治療鼻炎的作用，為深入探討其發揮作用的藥效物質基礎和作用機制提供參考與研究思路。后續可通過體內外實驗對活性成分和核心靶點進行驗證，以進一步明確黃芪治療鼻炎的作用機制。