茶樹根際土壤解磷菌的篩選鑒定及生物活性驗證

龐曉敏

（武夷學院信息技術與實驗室管理中心，福建 南平 354300）

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是一種有益菌類，存在于土壤中，有的附生在植物的根系，為植物提供營養物質和生長調節物質，并分泌拮抗物質，誘導植株系統抗性產生，從而幫助植株抵御有害生物體的侵襲[1]。同時，它還可以通過改善根際土壤的物理和化學性質，從根本上提高植物對根際土壤中營養元素的吸收利用，進而促進植物生長[2]；還可以通過分泌有機酸、植物生長激素、生物表面活性劑以及鐵載體等方式直接或間接促進植物生長[3]。其中，解磷微生物受到廣泛關注。早在1930 年，前蘇聯的科學家從土壤中分離篩選到1 株解磷能力比較強的芽孢桿菌[4]。19 世紀50 年代，科學家們從小麥的根際土壤中分離篩選到具有溶解磷酸鈣能力比較強的解磷細菌[5]。目前科學家在不同的植物根際中篩選到多種解磷菌[6-10]。

茶 樹[Camellia sinensis（L.）O. Ktze.]，原 名 茶，為山茶科山茶屬小喬木或灌木，源自中國西南部，具喜酸、耐鋁、積氟特性，根系在土壤中分布廣泛，從而形成獨特的茶樹根系土壤微生物棲息地[11]。茶樹根際微生物種類繁多，其作用也各異，有些菌株可以提高茶樹適應環境所需要的抗性（如抗寒、抗旱，抗鹽等），有些菌株可防止植物病菌對茶樹的侵害，還有些菌株可促進茶樹生長、提高茶葉品質[12-13]。但目前對于茶樹根際解磷菌的篩選報道較少[14]。因此，筆者以武夷巖茶茶樹根際土壤為研究對象，擬從中分離具有強解磷效果的細菌，并對篩選到的解無機磷細菌進行生物學鑒定和活性測試，以期為提高茶葉產質量、減少化肥施用提供有效的資源。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

茶樹根際土壤采集自南平市武夷山市武夷學院科教園（117°59′E，27°44′N），茶樹品種為肉桂、水仙和奇蘭。南平市武夷山地區屬于亞熱帶季風氣候帶，該地區四季溫和濕潤，年平均氣溫在16℃左右，年平均降水量達2 000 mm 以上，土壤以山地黃紅壤為主。2020 年9 月，在樹干中心0.5 m 范圍內避開施肥點采集深度為10～20 cm 的土層毛細根，將根上土壤抖落到無菌袋中并迅速帶回實驗室放在4℃的冰箱里保存，用于后續的解磷細菌篩選分離純化。

1.2 試驗方法

1.2.1 解磷菌的分離及純化 稱取茶樹根際土壤5 g，倒進裝有45 mL 無菌水的50 mL 三角瓶中，放入搖床（180 r/min）震蕩30 min，按10 倍稀釋法分別稀釋成10-3、10-4、10-5的土壤懸浮液，取200 μL 懸浮液于滅菌后的LB 固體培養基（胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.00 g/L，瓊脂15 g/L，pH值7.0）上進行平板涂布，每個梯度設置3 個重復，在28℃的恒溫培養箱培養48 h，觀察不同菌落長勢以及菌落的生長情況，方便后期分離純化。將培養皿中不同特征的菌株挑出，接種于LB 固體培養基，反復接種4 次，從而獲得純的菌株。把純化好的菌株接種于解無機磷固體培養基[葡萄糖10.0 g/L，(NH4)2SO40.5 g/L，KCl 0.3 g/L，NaCl 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，MnSO4·4H2O 0.03 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，Ca3(PO4)28.0 g/L，瓊脂15 g/L，pH 值7.0～7.5] ，挑選出具有解磷圈的菌落接種于高溫高壓滅菌后的LB 固體培養基中擴繁，然后再用LB 肉湯培養基發酵4 d，將發酵后的菌液與滅菌后的甘油溶液按照1 ∶1 進行混合，放入-20℃冰箱保存，以便后期的解磷能力測定。

1.2.2 解磷菌解磷能力測定和吲哚乙酸的產生量測定（1）解磷菌解磷圈測定：取分離純化后的菌落接種到解無機磷固體培養基中，32℃恒溫培養4 d，觀察并測量培養皿中透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），并做記錄。（2）解磷菌解磷能力測定：將具有解磷能力的菌株接種到解無機磷液體培養基中，放入搖床150 r/min，28℃震蕩培養4 d；將培養好的菌液放入超聲清洗機中超聲破碎20 min，將菌液倒入離心管，5 000 r/min 離心20 min；取2.5 mL 離心后的上清液，稀釋20 倍后，采用鉬銻抗比色法測定磷含量[15]，重復4次。（3）解磷菌IAA 含量測定：挑取菌株于50 mL的MM 培 養 基[KH2PO450 mol/L， K2HPO450 mol/L，MgSO45 mol/L，(NH4)2SO425 mol/L，1%葡萄糖，添加0.05%的L 型色氨酸]中25℃、180 r/min 培養7 d；將發酵液過濾定容至50 mL，10 000 r/min 離心10 min，取1 mL 上清液加入2 mL 的Salkowski’s 反應液（1 mL 0.5 mol/L FeCl3溶液與50 mL 35% HClO4溶液均勻混合），置于容量瓶中避光反應30 min，以離心后的空白培養基為對照，用分光光度計在波長530 nm處測定反應液的吸光值；用IAA 標準樣繪制標準曲線，然后計算發酵產生的IAA 含量。

1.2.3 菌株鑒定 （1）形態學鑒定：采用LB 培養基培養菌株，觀察菌株顏色和形狀等，并進行革蘭氏染色觀察。（2）分子生物學鑒定：將純化好的菌株送往北京奧維斯公司進行測序，測得菌株的16S rDNA 序列與NCBI 數據庫進行同源比對，利用MEGA 5.0 的鄰接法構建系統發育進化樹，進行遺傳進化分析[16]。

1.2.4 解磷菌對不同作物幼苗生長的影響 農作物種子（水稻208、水稻361、萵苣、生菜）用0.2%的次氯酸鈉浸泡30 min，然后用蒸餾水沖洗5 遍，將洗干凈的種子放入燒杯中進行催芽處理，等種子冒白即可種植。種植用土來自南平市武夷山市武夷學院科教園。用500 目篩將土過篩去除雜質。用自封袋封好帶回實驗室，將土壤均勻轉入培養瓶中，每瓶土壤重量為50 g，將稱好的土放進滅菌鍋121℃滅菌30 min，滅菌過后拿出冷卻至室溫。往土中施加菌液（0.1 g 菌+20 mL 稀釋20 倍的LB 培養基稀釋液），按2.5 kg 土加入500 mL 稀釋后的發酵液的比例給每份滅菌后的土壤加入稀釋的菌液，蓋上保鮮膜放在28℃的組培室黑暗培養2 d 備用，對照加等量的蒸餾水。2 d 后將冒白的種子均勻的播種在培養瓶中，每瓶5 株。蓋上瓶蓋，28℃培養（12 h 光照，12 h 黑暗），重復4 次，5 d 后測定幼苗的根長和株高。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 25.0 軟件進行數據整理、圖表繪制和方差分析，采用MEGA 5.0 軟件繪制進化樹。

2 結果與分析

2.1 茶樹根際土壤解磷菌的篩選與純化

通過稀釋涂布法共從3 個茶樹品種根際土壤中分離純化出46 個菌株，其中，水仙、肉桂和奇蘭品種根際土壤中分別獲得16、10 和20 株；46 個菌株進行解無機磷菌篩選，獲得2 株解磷菌，分別命名為JP001 和JP357，透明圈與菌落平均直徑比值（D/d）分別為2.2、1.7（表1），其中JP001 來自奇蘭根際土壤，JP357 來自水仙根際土壤。對 2 株解無機磷菌的菌落形態進行觀察，結果（表1）顯示：JP001 菌株形狀為圓形，表面光滑中間凸起，邊緣整齊，顏色為淡黃色；JP357 菌株形狀為圓形，表面光滑扁平，邊緣整齊，顏色為白色。進一步對2 株菌株進行革蘭氏染色鏡檢，結果如圖1 所示，2 個菌株均為紫色，屬于革蘭氏陽性菌（G+）。

圖1 解磷菌革蘭氏染色鏡檢結果

表1 分離菌株的菌落形態特征和解磷圈范圍

2.2 解磷菌的解磷和產IAA 能力測定

由 表2 可 知，JP001 菌 株 解 磷 量 為1.96 g/L，JP357 菌株解磷量為2.36 g/L，JP357 菌株解磷量是JP001菌株的1.20倍；JP001菌株 IAA產量為5.67mg/L，JP357 菌株 IAA 產量為11.24 mg/L，JP357 菌株產IAA量是JP001 菌株的1.98 倍。綜合二者解磷能力和IAA產量，發現JP357 菌株的解磷能力和產IAA 能力均顯著強于JP001 菌株。因此，后續的分子鑒定和生物測試試驗主要圍繞JP357 菌株展開。

表2 菌株的解磷和產IAA 能力

2.3 JP357 菌株的分子生物學鑒定

通過BLAST 軟件對JP357 菌株16S rDNA 序列進行比對分析，利用MEGA 5.0 的鄰接法構建系統發育進化樹如圖2 所示，JP357 菌株16S rDAN 序列與Paenibacillus polymyxa strain DSM 36 的同源性達99%，初步鑒定該菌株為Paenibacillus屬菌。

圖2 JP357 菌株的系統發育樹

2.4 JP357 菌株對不同作物幼苗生長的影響

由表3 可知，JP357 菌株可以顯著促進萵苣根部和地上部的生長（P＜0.05），與對照相比，根長增加了40%，株高增加了35%；JP357 菌株對生菜的根長和株高影響均不顯著；JP357 菌株可以顯著促進水稻根部和地上部的生長（P＜0.05），水稻208、水稻361 的根長分別比CK 增加30%、104%，株高分別增加54%、16%。

表3 JP357 菌株對不同作物幼苗生長的影響 （cm）

3 結論與討論

土壤中具有解磷能力的解磷微生物在土壤磷循環中起著重要作用。該研究從茶樹的根際土壤中分離篩選得到了2 株解無機磷菌，分別命名為JP001 和JP357，2 個菌株均為革蘭氏陽性菌，其中JP357 菌株的解磷和產IAA 能力強于JP001；JP357 菌株16S rDAN 序 列 與Paenibacillus polymyxastrain DSM 36 的同源性達99%，初步鑒定該菌株為Paenibacillus屬菌。

目前，以Paenibacillus屬菌進行生物防治的研究報道較多[17-19]，但關于其解磷能力的研究報道較少。該研究結果表明，Paenibacillus屬菌株也具有解無機磷能力，且JP357 菌株對萵苣和水稻幼苗的生長都有顯著促進作用，表明該菌株可用于菌肥的開發。該研究中幼苗培育是在組培室中進行，生存環境有一定的空間局限性，對作物的地下部生長會產生一定不良影響；同時，采用的土壤也是經過細篩滅菌的，而大自然中的土壤通常存在一定的微生物種群和數量，且不同土壤的保水保肥能力及通透性等都會有所差異。因此，JP357 菌株在大田試驗條件下的功效有待進一步試驗驗證。