KLF1基因變異致遺傳性溶血性貧血1例

盧琳， 胡繼芬， 陳麗紅， 何麗丹， 吳秀燕， 李建華

遺傳性溶血性貧血(hereditary hemolytic anemia， HHA)是由于編碼紅細胞膜蛋白、紅細胞代謝酶及血紅蛋白的基因突變引起的一組遺傳異質性貧血[1]。HHA病因復雜多樣，不同病因引起的溶血常表現出相似的臨床特點，如黃疸、肝脾腫大、紅細胞壽命縮短或破壞增多、骨髓紅系增生、輸血依賴性溶血性貧血等，常需進行多項檢測才能明確溶血原因，有時甚至存在病因未明現象。目前，已發現的KLF1基因變異可產生廣泛的臨床表型，如遺傳性胎兒血紅蛋白持續表達(hereditary persistence of fetal hemoglobin， HPFH)、臨界性HbA2水平升高、Lutheran血型、HHA和先天性紅細胞生成不良性貧血Ⅳ型(congenital dyserythropoietic anemia Ⅳ， CDA-Ⅳ)等。

KLF1基因位于染色體19p13.13，跨越2.78 kb的基因組DNA，由3個外顯子組成，編碼362個氨基酸。KLF1蛋白包含2個N端反轉錄激活域(TAD1、TAD2)、3個C端鋅指(ZF1、ZF2和ZF3)形成DNA結合域，能夠與相應的靶基因位點特異性結合(圖1)。KLF1基因變異所致的HHA呈常染色體隱性遺傳，患者臨床上常表現為小細胞低色素性貧血、黃疸、肝脾腫大，目前最有效的治療手段是定期輸血，脾切除并不能使該病得到有效緩解，骨髓移植的有效性也尚未見文獻報道。此類病例十分罕見，在高通量測序技術廣泛開展前，可能存在漏診或誤診，因此真實發病率可能被低估。

KLF1基因位于19p13，定位用紅色箭頭表示，由3個外顯子組成(Exon1、Exon2、Exon3)。黑框：編碼區；白框：非編碼區；藍線為內含子區域；紅框為氮端的反式激活域。與本研究突變相對應的核苷酸改變用紅色字體表示，與本研究相對應的編碼序列改變用藍色字體表示。KLF1蛋白包含2個氮端反轉錄激活域和3個碳端(C2H2)鋅指結合域。圖1 KLF1基因位置及結構圖Fig.1 KLF1 gene location and structure

本研究分析1例HHA患兒的致病原因，采用高通量測序技術進行相關基因變異分析，對可疑致病變異位點進行Sanger測序驗證，檢測到患兒KLF1基因存在c.519_525dupCGGCGCC(p.Gly176ArgfsTer*179)和c.1012C>A(p.Pro338Thr)復合雜合變異，并復習文獻發現，該病例為目前已知的KLF1基因突變導致HHA的第6個報道(共累及14例)，且在國內為首次報道，現將該病例及文獻復習情況匯總如下。

1 病例介紹

1.1 臨床資料 患兒，男，5歲，系第1胎第1產，孕母定期產檢未見異常，足月順產，出生時Apgar評分10-10-10，外觀無畸形，出生后當天即出現皮膚明顯黃染，轉入當地醫院新生兒科治療。出生后半個月因皮膚及鞏膜黃染加重、持續性高膽紅素血癥及嚴重貧血予輸血治療后癥狀好轉，之后每3個月輸血1次，維持至今。家族史：父母非近親婚配且身體健康，否認家族遺傳病史。查體：神志清楚，對答配合，中度貧血面容，皮膚、眼瞼膜、口唇黏膜及甲床均蒼白，全身淺表淋巴結未觸及腫大，心肺聽診無明顯異常。腹軟，無壓痛、反跳痛。肝臟肋緣下未觸及，脾臟肋緣下2 cm。輔助檢查：血常規示白細胞(white blood cell， WBC)15.26×109L-1，血紅蛋白74 g/L，平均紅細胞體積(mean red blood cell volume， MCV)81 fl，平均紅細胞血紅蛋白量(mean erythrocyte hemoglobin， MCH)32.5 pg，血小板(platelet，PLT)228×109L-1；外周血檢查提示為小細胞低色素性貧血、網織紅細胞比例增多；肝功能示丙氨酸氨基轉移酶和天門冬氨酸氨基轉移酶均正常，總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素分別為82.0、12.5和69.5 μmol/L。骨髓穿刺可見紅細胞系大量增生、核碎裂現象。未檢出常見的α、β地中海貧血基因缺失或變異。當地醫院進行了血紅蛋白電泳、Coombs試驗、紅細胞滲透脆性試驗、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD)試驗等相關檢查，結果排除了常見的溶血性疾病，如地中海貧血、同種免疫性溶血、遺傳性球形細胞增多癥、G-6-PD缺乏癥等。患兒的生長及智力發育在正常水平。臨床診斷“貧血原因待查”。為進一步明確診斷及要求優生咨詢就診筆者醫院。本研究經醫院倫理委員會審查批準(〔2016〕005號)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及DNA提取 在充分溝通并簽署知情同意書后，抽取患兒及其父母外周血各3 mL， EDTA抗凝。采用DNA Mini Kit試劑盒(德國Qiagen公司)提取外周血基因組DNA，-20 ℃保存。

1.2.2 高通量測序檢測及Sanger測序驗證 將基因組DNA打斷成片段并構建基因組文庫，通過探針雜交捕獲與遺傳病相關的基因外顯子及鄰近內含子區域(±10 bp)進行測序。富集后的DNA片段在高通量測序儀(NovaSeq 6000，美國Illumina公司)上測序。根據與臨床表型相關的疑似致病位點設計引物，并對患兒及其父母的目標序列進行Sanger 測序，分析測序結果。

1.2.3 變異位點致病性分析 測序獲得的原始數據應用Burrow-Wheeler Aligner(BWA，version 0.7.12)軟件進行人類基因組參考序列比對，用Genome Analysis Toolkit(GATK， version 3.3)軟件對核苷酸多態性、插入、缺失進行檢測和統計分析。用Annovar軟件進行變異的篩選和注釋，用千人基因組數據庫和dbSNP等數據庫對檢出的變異進行嚴格過濾，用Mutation taster等軟件對可疑變異進行預測分析。嚴格按照美國醫學遺傳學與基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics， ACMG)遺傳變異分類標準與指南對變異位點進行致病性分析[2]。

1.2.4 文獻來源與檢索方法 檢索以“KLF1”“溶血性貧血”“Kruppel-Like Factor 1”“congenital hemolytic anemia”“hypochromic anemia”為關鍵詞在PubMed、中國知網、中國生物醫學文獻數據庫、萬方醫學網、維普中文生物醫學期刊等數據庫進行檢索。

1.3 結果

1.3.1 基因測序結果 全外顯子組測序發現，患兒攜帶KLF1基因(NM_006563.3)復合雜合變異，包括第2個外顯子c.519_525dupCGGCGCC(p.Gly176ArgfsTer*179)的移碼突變和第3個外顯子c.1012C>A(p.Pro338Thr)的錯義突變，變異分別來源于患兒母親和父親。Sanger測序圖見圖2。

1.3.2 變異位點致病性分析結果KLF1基因c.519_525dupCGGCGCC(p.Gly176ArgfsTer*179)為無功能性變異。根據ACMG指南的判斷標準，該變異被判定為致病性變異(PVS1+PS4+PM2)。c.1012C>A(p.Pro338Thr)根據ACMG指南的判斷標準被判定為可能致病性(PS4+PM2+PM5+PP3)。

1.3.3 文獻回顧分析結果 關于HHA的病例最早于2014年報道，共檢索到符合KLF1變異導致HHA診斷的文獻5篇，均為外文文獻，累及患兒13例，男女比例為10∶2(其中1例文獻未訴性別)，就診年齡大多在胎兒期到4歲之間(1例12歲)。病因均為KLF1上的2個核苷酸位點發生復合雜合變異，臨床表型極其相似，如貧血、黃疸、肝脾腫大，主要治療手段均為定期輸血。

A：先證者c.519_525dupCGGCGCC雜合變異；B：先證者c.1012C>A雜合變異；C：母親c.519_525dupCGGCGCC雜合變異；D：父親c.1012C>A雜合變異(紅色箭頭表示突變位點)。圖2 KLF1基因Sanger測序圖Fig.2 Sanger sequencing of KLF1 gene

2 討 論

HHA常發生于嬰幼兒期，輕型患者也可能到成年后才被發現。該病是因紅細胞的內在先天性缺陷所導致，常見的臨床表現有黃疸、肝脾腫大、貧血、高膽紅素血癥、骨髓造血增生活躍等。治療手段也因病因不同不盡相同。近年來，HHA的診療技術雖有所進展，但仍不盡人意，血庫技術的發展大大改善了患兒的預后[3]。

KLF1是一種紅細胞生成的關鍵性轉錄因子，參與激活、抑制、調節多個血型抗原表達、珠蛋白基因表達和轉換、細胞循環及周期、血紅素合成酶、細胞膜及細胞骨架、自噬調節、血紅蛋白合成等多個環節，幾乎控制了紅細胞發育與成熟的所有方面[4]。一項針對KLF1基因敲除的小鼠胚胎因嚴重紅細胞缺陷導致死亡的研究也證實，KLF1基因對紅細胞的生成起著關鍵性作用[5]。

KLF1基因突變分為4種類型，主要通過影響蛋白編碼序列影響其轉錄活性[6]：(1)突變位于DNA結構域外，不影響或輕微影響功能。(2)突變在DNA結構域內，包括一些錯義突變和小的編碼區缺失，能影響基因功能。(3)無義突變或移碼突變，能產生截短蛋白，為功能性突變。(4)顯性突變，使ZF2上一個高度保守的氨基酸發生錯義突變(p.E325K)，導致嚴重的CDA-Ⅳ(#613673)。目前，HGMD數據庫收錄的KLF1變異已有60余種，盡管鋅指結構僅占KLF1的20%，但大部分錯義突變均位于這個結構域內或之間[7]。

不同類型的突變可對下游靶基因產生不同的影響，從而引起廣泛的臨床表型，由表型輕微的罕見In(Lu)(inhibitor of Lutheran)血型攜帶、HPFH、臨界性HbA2水平升高，到嚴重的遺傳性血紅蛋白疾病，如CDA-Ⅳ型、HHA，甚至出現胎兒水腫及胚胎致死[8-15]。因KLF1雜合突變常表現為單倍劑量不足[16]，大多數攜帶者通過傳統篩查難以發現。在中國南方，KLF1基因突變的攜帶率為1.25%，而北方攜帶率為0.08%[17]。但在應用高通量測序技術之前，KLF1基因變異極其罕見。因此由其導致的遺傳性血液疾病的病因無法闡明，推測部分死胎可能與該基因功能受損有關。

本例中KLF1基因c.519_525dupCGGCGCC(p.Gly176ArgfsTer*179)為移碼變異，會導致所編碼蛋白質自第176位甘氨酸開始發生移碼，從而產生1個缺失ZF結構域的截短蛋白，為無功能性變異。c.1012C>A(p.Pro338Thr)位于ZF2和ZF3結構域之間，在GnomAD基因組聚合數據庫中有收錄，在ESP6500siv2_ALL、千人基因組(1000g2015aug_ALL)和dbSNP147等數據庫正常對照人群中未發現，該變異在人群中發生頻率極低(0.000 05)，但在同一個突變位點導致另一個氨基酸發生的變異chr19:12995776G>A(Pro338Ser)已被確認是致病性的，且該病表型與患者癥狀高度相符。對不同哺乳動物的KLF1進行比對后發現，338位點的Pro保守。經Mutation taster、Mutation Assessor等軟件進行預測分析其均有致病可能，會使所編碼蛋白質第338位氨基酸由脯氨酸變為蘇氨酸。對同源性基因的建模發現，第338位的脯氨酸變為蘇氨酸能通過破壞R337和A347之間的氫鍵，導致二級結構松弛，從而改變ZF1和ZF2之間正常的橋接結構，對KLF功能造成有害影響[18]。

VIPRAKASIT等[13]對8例嚴重的溶血性貧血患者的研究發現，患兒均是KLF1復合雜合子突變，表型與遺傳性非球形細胞溶血性貧血極其相似。總結全球已報道的13例KLF1基因復合雜合變異所致的HHA發現，患兒均攜帶2種不同的二類突變或是1種二類突變與1種三類突變共存的復合雜合狀態；幾乎所有患兒都在嬰幼兒期發病，臨床表現為貧血、黃疸、脾腫大，大部分需要定期輸血維持治療(僅1例在不輸血的情況下血紅蛋白濃度能維持在80～90 g/L)。本研究中的患兒與文獻報道的2例的復合雜合變異完全相同，1例為水腫胎，分別于孕27、29、34周行胎兒宮內輸血治療后，于孕34周分娩，出生后仍需每月輸血1次，患兒體質量明顯低于同齡兒水平[13]；另1例為男嬰，出生后有嚴重的貧血，立即予輸血治療，此后定期輸血[19]。但需要注意的是，并非所有的KLF1復合雜合突變都有嚴重的臨床表型，與KLF1突變產生的蛋白類型及對靶基因的影響有關。對其中8例溶血性貧血的患者進行紅細胞酶活性檢測發現，丙酮酸激酶(pyruvate kinase， PK)缺乏，但對編碼PK的相關基因進行測序并未發現變異[12]。進一步研究發現，KLF1基因能特異性地與PKLR基因啟動子結合，推測KLF1部分類型的突變可能影響PK的功能，從而產生與遺傳性非球形細胞溶血性貧血相似的臨床表型，表明KLF1還能與其他基因協同作用參與溶血性貧血的發病。

本病例與已報道的病例有著十分相似的臨床特點，與前兩例相同突變位點病例不同的是，該患兒在孕期并無胎兒水腫，出生后定期輸血的時間間隔也較長，且生長發育正常。推測即使具有相同突變位點的復合雜合變異，臨床表型的嚴重程度也可能存在差異，這為今后的遺傳咨詢提供了指導信息。

綜上所述，筆者對1例HHA患兒進行了KLF1基因變異分析，證實了KLF1復合雜合突變為其致病原因。該報道不僅豐富了HHA的基因診斷，也為進一步研究KLF1基因突變與臨床表型嚴重程度的關系提供了新的依據。