全外顯子測(cè)序技術(shù)檢測(cè)一家系先天性手指屈曲畸形基因突變

嚴(yán)爭(zhēng)， 陳珊， 劉凡， 陳俊， 黃青蘭， 陳曉婷

先天性手指屈曲畸形是一種常見的先天性手指畸形，由幾種組織發(fā)育不良所致，包括掌面皮膚不足、指淺屈肌腱短縮、指伸腱結(jié)構(gòu)松弛發(fā)育不全、蚓狀肌錯(cuò)位附著、側(cè)副韌帶及掌板短縮等[1]。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示[2]，目前我國(guó)先天性手部畸形的發(fā)病率為1/2 000，男性顯著高于女性，以先天性手指屈曲畸形占比較大，不僅嚴(yán)重影響患兒手功能的發(fā)揮，而且對(duì)患兒的生理和心理發(fā)育也有較大影響。患者確診后即需采取按摩、支具伸直位固定、手術(shù)矯正、功能訓(xùn)練以及心理治療等，給患者個(gè)人及其家庭增加了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理壓力[3]。

目前，先天性手指屈曲畸形已被證明顯示出常染色體顯性遺傳模式，即指缺陷基因呈顯性表達(dá)，50%的子女均可能發(fā)病[4-5]。本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)我國(guó)一個(gè)先天性手指屈曲畸形家系的先證者及其父親、母親、爺爺進(jìn)行全外顯子測(cè)序，并進(jìn)行拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNV)分析，根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行解讀，發(fā)現(xiàn)FBN2基因上一個(gè)突變位點(diǎn)(c.3398A>G)，該突變未被報(bào)道，可能是先天性手指屈曲畸形的致病原因，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 先證者，男，5歲，臨床表現(xiàn)為手部骨骼異常，手指不能伸展，手指可直向活動(dòng)、可握拳，出生時(shí)即表現(xiàn)為手指屈伸畸形。查體顯示智力正常，未見其他組織器官異常。家族史顯示，先證者的父親、爺爺均表現(xiàn)為手指屈曲畸形。本研究經(jīng)福州市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受檢者均知情同意。

1.2 DNA提取和全外顯子測(cè)序 對(duì)先證者及其父親、母親和爺爺進(jìn)行遺傳咨詢，繪制家族遺傳圖譜。采集先證者及其家屬3代共計(jì)4人的外周血，使用全血基因組DNA提取試劑盒提取外周血DNA。對(duì)外周血DNA進(jìn)行基于illumina二代測(cè)序平臺(tái)，采用Agilent SureSelectXTHuman All Exon V6 kit進(jìn)行捕獲建庫(kù)，利用雙末端(150 bp X 2)測(cè)序的方法，完成臨床樣本的全外顯子組測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析 全外顯子組測(cè)序結(jié)果參考dbSNP、ClinVar、OMIM、NCBI、MalaCards、UCSC Genome Browser和DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)，以及北京貝康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所提供的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)芯片進(jìn)行CNV分析，去除位于內(nèi)含子中的突變、同義突變以及頻率≥0.01的變異位點(diǎn)，優(yōu)先對(duì)先天性手指屈曲畸形相關(guān)已知致病基因進(jìn)行變異位點(diǎn)分析，并結(jié)合已發(fā)表文獻(xiàn)對(duì)篩選出的基因進(jìn)行致病性分析。

2 結(jié) 果

2.1 家系遺傳分析 先證者家族3代共計(jì)4人的家系遺傳圖譜見圖1，表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳特性。先天性手指屈曲畸形在先證者家族中垂直傳遞，每代家族成員均患病。先證者臨床表現(xiàn)為手部骨骼異常，雙手手指不能完全伸展(圖2A)，其父親(圖2B)和爺爺(圖2C)均有類似臨床表現(xiàn)。3例均未發(fā)現(xiàn)其他疾病。

2.2 全外顯子測(cè)序質(zhì)量控制 先證者外周血樣本測(cè)序的平均覆蓋深度為122.61X，大于10X覆蓋區(qū)域占97.43%，大于20X覆蓋區(qū)域占93.82%；先證者母親外周血樣本測(cè)序的平均覆蓋深度為136.88X，大于10X覆蓋區(qū)域占97.46%，大于20X覆蓋區(qū)域占94.40%；先證者父親外周血樣本測(cè)序的平均覆蓋深度為100.84X，大于10X覆蓋區(qū)域占96.65%，大于20X覆蓋區(qū)域占91.82%；先證者爺爺外周血樣本測(cè)序的平均覆蓋深度為121.34X，大于10X覆蓋區(qū)域占97.39%，大于20X覆蓋區(qū)域占93.69%。

方形為男性，圓形為女性，黑色為先天性手指屈曲畸形，五角星表明已經(jīng)獲取其外周血臨床樣本進(jìn)行全外顯子組測(cè)序。圖1 先證者家系遺傳圖譜Fig.1 Genetic map of the proband’s family

A：先證者；B：先證者父親；C：先證者爺爺。圖2 先證者及其父親、爺爺手部圖Fig.2 Hand images of the proband and his father and grandfather

2.3 全外顯子測(cè)序結(jié)果 本研究對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行CNV分析，數(shù)據(jù)分析以GRCh37(hg19)基因組版本為依據(jù)，結(jié)果顯示：先證者FBN2基因26號(hào)外顯子存在一個(gè)遺傳自父親的雜合突變c.3398A>G(p.N1133S)，為錯(cuò)義突變，先證者爺爺也攜帶該變異。該變異在正常參考人群基因數(shù)據(jù)庫(kù)未見報(bào)道；計(jì)算機(jī)輔助分析預(yù)測(cè)該變異影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能可能性較大。依據(jù)ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南對(duì)檢出變異進(jìn)行解讀。結(jié)果檢出FBN2基因26號(hào)外顯子上存在一個(gè)雜合突變：NM_001999 (FBN2): c.3398A>G(p.N1133S)(表1，圖3)，遺傳自父親。該突變可能導(dǎo)致FBN2蛋白第288位氨基酸由精氨酸變?yōu)榘腚装彼帷Ｔ谇嘶蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)、ESP6500數(shù)據(jù)庫(kù)、Exome Aggregation Consortium(ExAC)數(shù)據(jù)庫(kù)和ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)中均不存在這種錯(cuò)義突變。經(jīng)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)：該基因突變?yōu)橛泻?SIFT: Damaging; Polyphen 2_HDIV: possibly damaging; Polyphen2_HVAR: possibly damaging; Mutation taster: disease_causing)，蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可能有害(Polyphen2, SIFT, Mutation taster)，軟件預(yù)測(cè)該核苷酸具有高度保守性(GERP, phyloP, phastCons)。依據(jù)ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南，判定該變異為可能致病性變異，其致病證據(jù)等級(jí)為PM2+PP1+PP3。

表1 全外顯子測(cè)序結(jié)果與解讀

圖3 FBN2基因c.3398A>G變異的測(cè)序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of c.3398A>G variant in FBN2 gene

3 討 論

先天性手指屈曲畸形是一種常染色體顯性遺傳性疾病，以食指、中指和小指單獨(dú)或多個(gè)手指關(guān)節(jié)無法正常伸展為主要臨床表現(xiàn)[4-5]。先天性手指屈曲畸形可分為3類，即嬰幼兒期手指屈曲畸形(男女發(fā)病率相似)、青春期手指屈曲畸形(女性多發(fā))以及先天性畸形綜合征伴手指屈曲畸形(最常見)[6-7]。本研究報(bào)道的一家系3代3例先天性手指屈曲畸形均為嬰幼兒期手指屈曲畸形，先證者為5周歲的男童，其父親和爺爺均患有先天性手指屈曲畸形，3例患者均未見其他組織器官障礙，符合先天性手指屈曲畸形常染色體顯性遺傳特征。

本研究對(duì)先證者及其父親、母親、爺爺進(jìn)行外周血DNA全外顯子測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，先證者FBN2基因26號(hào)外顯子存在一個(gè)遺傳自父親的雜合突變c.3398A>G(p.N1133S)，為錯(cuò)義突變，先證者爺爺也攜帶該變異。FBN2的全稱是原纖維蛋白2，包含具有5個(gè)不同結(jié)構(gòu)區(qū)域的多域蛋白[8-9]；最大的一個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域包含41個(gè)鈣結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子 (cbEGF)樣結(jié)構(gòu)域，每個(gè)cbEGF樣結(jié)構(gòu)域的天然蛋白質(zhì)折疊均由6個(gè)保守的半胱氨酸殘基組成，它們形成3個(gè)二硫鍵以維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性[10-11]。目前人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)已報(bào)告的120種FBN2基因突變均聚集在這個(gè)區(qū)域，特別是位于外顯子22～36[12-13]。本研究報(bào)道的FBN2基因突變即位于FBN2基因的26號(hào)外顯子(c.3398A>G)。

FBN2突變應(yīng)該是通過改變關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)(半胱氨酸)、刪除整個(gè)cbEGF樣結(jié)構(gòu)域，或通過在cbEGF樣結(jié)構(gòu)域中插入新的糖基化位點(diǎn)，從而改變中心結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)[12-13]。目前在FBN2中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)突變都位于重復(fù)序列區(qū)域，而本研究新報(bào)道的FBN2 c.3398A>G(p.N1133S)突變同樣位于重復(fù)序列區(qū)域。之前關(guān)于FBN2突變的報(bào)道以先天性攣縮性蛛網(wǎng)膜炎為主，并且FBN2基因是唯一已知與先天性攣縮性蛛網(wǎng)膜炎發(fā)病有關(guān)的基因[14]。先天性攣縮性蛛網(wǎng)膜炎也稱為Beals綜合征，是一種常染色體顯性遺傳的結(jié)締組織疾病，其臨床特征是多處屈曲攣縮、蛛網(wǎng)膜下裂、嚴(yán)重的脊柱后側(cè)凸、耳廓異常和肌肉發(fā)育不全[15]。LIU等[16]報(bào)道過一家系cbEGF功能域中的雜合錯(cuò)義變體，其在FBN2 cbEGF域中產(chǎn)生折疊不穩(wěn)定性，從而引發(fā)先天性攣縮性蛛網(wǎng)膜炎癥狀，導(dǎo)致該家系3代人均存在不同程度的手指屈曲畸形。此外，YOU等[17]也報(bào)道一家系FBN2外顯子32的第4 216位核苷酸處存在雜合T → C顛換，導(dǎo)致該家系3代人均出現(xiàn)先天性攣縮性蛛網(wǎng)膜炎癥狀，但與本研究報(bào)道的家系不同的是，該家系同時(shí)存在手指屈曲畸形和足部骨骼異常。與之前的FBN2突變引起的先天性攣縮性蛛網(wǎng)膜炎綜合表型不同，本研究FBN2突變患者并未表現(xiàn)出先天性攣縮性蛛網(wǎng)膜炎的其他表型，比如心血管或其他神經(jīng)肌肉異常，原因可能如下：FBN2基因的突變可根據(jù)受影響的殘基分為3類，而影響鈣結(jié)合共有序列中殘基的突變可能會(huì)降低鈣結(jié)合親和力，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。本研究中，p.N1133S 取代破壞了主鏈的轉(zhuǎn)向，使剩余的Ca2+配體能夠占據(jù)配位位置和 Gly1145-Phe1143 之間的氫鍵，這有助于穩(wěn)定帶負(fù)電荷的氧原子之間的不利接近，從而可能削弱鈣結(jié)合親和力，影響患者的骨骼發(fā)育。

總之，本研究報(bào)道了一個(gè)中國(guó)人群中先天性手指屈曲畸形家系，該家系3代人中有3例男性患病，呈現(xiàn)常染色體顯性遺傳特征。對(duì)先證者進(jìn)行外周血DNA全外顯子測(cè)序篩查出FBN2 c.3398A>G(p.N1133S)突變，先證者父親和爺爺均攜帶該突變，故該突變被認(rèn)為是本家系先天性手指屈曲畸形發(fā)病的主要分子基礎(chǔ)。