全外顯子測序技術檢測一家系先天性手指屈曲畸形基因突變

嚴爭， 陳珊， 劉凡， 陳俊， 黃青蘭， 陳曉婷

先天性手指屈曲畸形是一種常見的先天性手指畸形，由幾種組織發育不良所致，包括掌面皮膚不足、指淺屈肌腱短縮、指伸腱結構松弛發育不全、蚓狀肌錯位附著、側副韌帶及掌板短縮等[1]。流行病學統計數據顯示[2]，目前我國先天性手部畸形的發病率為1/2 000，男性顯著高于女性，以先天性手指屈曲畸形占比較大，不僅嚴重影響患兒手功能的發揮，而且對患兒的生理和心理發育也有較大影響。患者確診后即需采取按摩、支具伸直位固定、手術矯正、功能訓練以及心理治療等，給患者個人及其家庭增加了嚴重的經濟負擔和心理壓力[3]。

目前，先天性手指屈曲畸形已被證明顯示出常染色體顯性遺傳模式，即指缺陷基因呈顯性表達，50%的子女均可能發病[4-5]。本研究通過高通量測序技術對我國一個先天性手指屈曲畸形家系的先證者及其父親、母親、爺爺進行全外顯子測序，并進行拷貝數變異(copy number variation, CNV)分析，根據美國醫學遺傳學與基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)遺傳變異分類標準與指南對測序結果進行解讀，發現FBN2基因上一個突變位點(c.3398A>G)，該突變未被報道，可能是先天性手指屈曲畸形的致病原因，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 先證者，男，5歲，臨床表現為手部骨骼異常，手指不能伸展，手指可直向活動、可握拳，出生時即表現為手指屈伸畸形。查體顯示智力正常，未見其他組織器官異常。家族史顯示，先證者的父親、爺爺均表現為手指屈曲畸形。本研究經福州市第一醫院倫理委員會批準，受檢者均知情同意。

1.2 DNA提取和全外顯子測序 對先證者及其父親、母親和爺爺進行遺傳咨詢，繪制家族遺傳圖譜。采集先證者及其家屬3代共計4人的外周血，使用全血基因組DNA提取試劑盒提取外周血DNA。對外周血DNA進行基于illumina二代測序平臺，采用Agilent SureSelectXTHuman All Exon V6 kit進行捕獲建庫，利用雙末端(150 bp X 2)測序的方法，完成臨床樣本的全外顯子組測序。

1.3 生物信息學分析 全外顯子組測序結果參考dbSNP、ClinVar、OMIM、NCBI、MalaCards、UCSC Genome Browser和DECIPHER數據庫，以及北京貝康醫學檢驗所提供的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)芯片進行CNV分析，去除位于內含子中的突變、同義突變以及頻率≥0.01的變異位點，優先對先天性手指屈曲畸形相關已知致病基因進行變異位點分析，并結合已發表文獻對篩選出的基因進行致病性分析。

2 結 果

2.1 家系遺傳分析 先證者家族3代共計4人的家系遺傳圖譜見圖1，表現為常染色體顯性遺傳特性。先天性手指屈曲畸形在先證者家族中垂直傳遞，每代家族成員均患病。先證者臨床表現為手部骨骼異常，雙手手指不能完全伸展(圖2A)，其父親(圖2B)和爺爺(圖2C)均有類似臨床表現。3例均未發現其他疾病。

2.2 全外顯子測序質量控制 先證者外周血樣本測序的平均覆蓋深度為122.61X，大于10X覆蓋區域占97.43%，大于20X覆蓋區域占93.82%；先證者母親外周血樣本測序的平均覆蓋深度為136.88X，大于10X覆蓋區域占97.46%，大于20X覆蓋區域占94.40%；先證者父親外周血樣本測序的平均覆蓋深度為100.84X，大于10X覆蓋區域占96.65%，大于20X覆蓋區域占91.82%；先證者爺爺外周血樣本測序的平均覆蓋深度為121.34X，大于10X覆蓋區域占97.39%，大于20X覆蓋區域占93.69%。

方形為男性，圓形為女性，黑色為先天性手指屈曲畸形，五角星表明已經獲取其外周血臨床樣本進行全外顯子組測序。圖1 先證者家系遺傳圖譜Fig.1 Genetic map of the proband’s family

A：先證者；B：先證者父親；C：先證者爺爺。圖2 先證者及其父親、爺爺手部圖Fig.2 Hand images of the proband and his father and grandfather

2.3 全外顯子測序結果 本研究對高通量測序結果進行CNV分析，數據分析以GRCh37(hg19)基因組版本為依據，結果顯示：先證者FBN2基因26號外顯子存在一個遺傳自父親的雜合突變c.3398A>G(p.N1133S)，為錯義突變，先證者爺爺也攜帶該變異。該變異在正常參考人群基因數據庫未見報道；計算機輔助分析預測該變異影響蛋白質結構或功能可能性較大。依據ACMG遺傳變異分類標準與指南對檢出變異進行解讀。結果檢出FBN2基因26號外顯子上存在一個雜合突變：NM_001999 (FBN2): c.3398A>G(p.N1133S)(表1，圖3)，遺傳自父親。該突變可能導致FBN2蛋白第288位氨基酸由精氨酸變為半胱氨酸。在千人基因組數據庫、ESP6500數據庫、Exome Aggregation Consortium(ExAC)數據庫和ClinVar數據庫中均不存在這種錯義突變。經生物信息學軟件預測：該基因突變為有害(SIFT: Damaging; Polyphen 2_HDIV: possibly damaging; Polyphen2_HVAR: possibly damaging; Mutation taster: disease_causing)，蛋白結構預測可能有害(Polyphen2, SIFT, Mutation taster)，軟件預測該核苷酸具有高度保守性(GERP, phyloP, phastCons)。依據ACMG遺傳變異分類標準與指南，判定該變異為可能致病性變異，其致病證據等級為PM2+PP1+PP3。

表1 全外顯子測序結果與解讀

圖3 FBN2基因c.3398A>G變異的測序結果Fig.3 Sequencing results of c.3398A>G variant in FBN2 gene

3 討 論

先天性手指屈曲畸形是一種常染色體顯性遺傳性疾病，以食指、中指和小指單獨或多個手指關節無法正常伸展為主要臨床表現[4-5]。先天性手指屈曲畸形可分為3類，即嬰幼兒期手指屈曲畸形(男女發病率相似)、青春期手指屈曲畸形(女性多發)以及先天性畸形綜合征伴手指屈曲畸形(最常見)[6-7]。本研究報道的一家系3代3例先天性手指屈曲畸形均為嬰幼兒期手指屈曲畸形，先證者為5周歲的男童，其父親和爺爺均患有先天性手指屈曲畸形，3例患者均未見其他組織器官障礙，符合先天性手指屈曲畸形常染色體顯性遺傳特征。

本研究對先證者及其父親、母親、爺爺進行外周血DNA全外顯子測序，結果發現，先證者FBN2基因26號外顯子存在一個遺傳自父親的雜合突變c.3398A>G(p.N1133S)，為錯義突變，先證者爺爺也攜帶該變異。FBN2的全稱是原纖維蛋白2，包含具有5個不同結構區域的多域蛋白[8-9]；最大的一個結構區域包含41個鈣結合表皮生長因子 (cbEGF)樣結構域，每個cbEGF樣結構域的天然蛋白質折疊均由6個保守的半胱氨酸殘基組成，它們形成3個二硫鍵以維持蛋白質穩定性[10-11]。目前人類基因突變數據庫已報告的120種FBN2基因突變均聚集在這個區域，特別是位于外顯子22～36[12-13]。本研究報道的FBN2基因突變即位于FBN2基因的26號外顯子(c.3398A>G)。

FBN2突變應該是通過改變關鍵結合位點(半胱氨酸)、刪除整個cbEGF樣結構域，或通過在cbEGF樣結構域中插入新的糖基化位點，從而改變中心結構域結構[12-13]。目前在FBN2中發現的大多數突變都位于重復序列區域，而本研究新報道的FBN2 c.3398A>G(p.N1133S)突變同樣位于重復序列區域。之前關于FBN2突變的報道以先天性攣縮性蛛網膜炎為主，并且FBN2基因是唯一已知與先天性攣縮性蛛網膜炎發病有關的基因[14]。先天性攣縮性蛛網膜炎也稱為Beals綜合征，是一種常染色體顯性遺傳的結締組織疾病，其臨床特征是多處屈曲攣縮、蛛網膜下裂、嚴重的脊柱后側凸、耳廓異常和肌肉發育不全[15]。LIU等[16]報道過一家系cbEGF功能域中的雜合錯義變體，其在FBN2 cbEGF域中產生折疊不穩定性，從而引發先天性攣縮性蛛網膜炎癥狀，導致該家系3代人均存在不同程度的手指屈曲畸形。此外，YOU等[17]也報道一家系FBN2外顯子32的第4 216位核苷酸處存在雜合T → C顛換，導致該家系3代人均出現先天性攣縮性蛛網膜炎癥狀，但與本研究報道的家系不同的是，該家系同時存在手指屈曲畸形和足部骨骼異常。與之前的FBN2突變引起的先天性攣縮性蛛網膜炎綜合表型不同，本研究FBN2突變患者并未表現出先天性攣縮性蛛網膜炎的其他表型，比如心血管或其他神經肌肉異常，原因可能如下：FBN2基因的突變可根據受影響的殘基分為3類，而影響鈣結合共有序列中殘基的突變可能會降低鈣結合親和力，導致結構不穩定。本研究中，p.N1133S 取代破壞了主鏈的轉向，使剩余的Ca2+配體能夠占據配位位置和 Gly1145-Phe1143 之間的氫鍵，這有助于穩定帶負電荷的氧原子之間的不利接近，從而可能削弱鈣結合親和力，影響患者的骨骼發育。

總之，本研究報道了一個中國人群中先天性手指屈曲畸形家系，該家系3代人中有3例男性患病，呈現常染色體顯性遺傳特征。對先證者進行外周血DNA全外顯子測序篩查出FBN2 c.3398A>G(p.N1133S)突變，先證者父親和爺爺均攜帶該突變，故該突變被認為是本家系先天性手指屈曲畸形發病的主要分子基礎。