基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測畬藥小香勾治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)潛在作用靶點(diǎn)和信號通路

林小惠， 汪余嘉， 聶雪坤， 張立， 林敏華， 艾克拜爾·熱合曼， 陳子春

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gout arthritis，GA)是尿酸結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)及其周邊軟組織導(dǎo)致的炎性代謝性風(fēng)濕疾病[1]，以關(guān)節(jié)紅腫熱痛為主要癥狀，并伴有不同程度的活動(dòng)功能障礙。如未及時(shí)治療，可能損傷關(guān)節(jié)，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)發(fā)生腎結(jié)石甚至腎衰竭，影響患者的生活質(zhì)量。目前，治療急性GA常用的一線藥物包括秋水仙堿、非甾體類抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)及糖皮質(zhì)激素等，雖然療效較為明確，但毒副作用多，耐受性低，復(fù)發(fā)率高。

小香勾為桑科植物條葉榕(FicuspandurataHance var.angustifoliaCheng)或全葉榕(FicuspandurataHance var.holophyllaMigo)的干燥根及莖，系畬族習(xí)用藥材，常用于關(guān)節(jié)疼痛、風(fēng)濕痹痛及痛風(fēng)等疾病[2]。現(xiàn)代臨床研究也表明，小香勾治療GA具有較好的臨床療效，顯著降低了急性GA的發(fā)作次數(shù)和藥物不良反應(yīng)發(fā)生率[3-4]，但其作用機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門建立在“疾病-靶點(diǎn)-基因-藥物”多層次網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上的新興學(xué)科，已廣泛應(yīng)用于藥物靶點(diǎn)預(yù)測及藥理機(jī)制研究[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究理念與中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)相適應(yīng)，為研究中藥活性成分相關(guān)作用靶點(diǎn)或信號通路提供了有利的技術(shù)支持。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，深入挖掘畬藥小香勾治療GA的潛在作用靶點(diǎn)和相關(guān)信號通路，以期為小香勾的深入研發(fā)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 小香勾活性成分和作用靶點(diǎn)預(yù)測 由于小香勾系畬族特有習(xí)用藥材，TCMSP及TCMID等常用中藥數(shù)據(jù)庫未收錄小香勾，因此本研究主要通過文獻(xiàn)檢索獲得其主要活性成分的相關(guān)信息[6]。小香勾對GA的抗炎鎮(zhèn)痛作用主要與以下6種活性成分相關(guān)：佛手柑內(nèi)酯(bergapten)、毛地黃黃酮(luteolin)、補(bǔ)骨脂素(psoralen)、蘆丁(rutin)、羥基香豆素(7-Hydroxycoumarin)及綠原酸(chlorogenic acid)。通過Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫收集上述活性成分的PubChem Cid、二維和三維結(jié)構(gòu)圖。由于上述活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫中收錄的潛在作用靶點(diǎn)較少或未收錄，因此主要通過Pharmmapper數(shù)據(jù)庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)對活性化合物進(jìn)行藥效團(tuán)模型靶點(diǎn)預(yù)測，收集小香勾相關(guān)活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 基于GeneCards(https://www.genecards.org/)，OMIM(http://www.omim.org/)，TTD(http://bidd.nus.edu.sg/

group/cjttd/)，Drugbank(https://go.drugbank.com/)，PharmGBK(https://www.pharmgkb.org/)數(shù)據(jù)庫，以“gouty arthritis”為檢索詞，獲取疾病相關(guān)靶點(diǎn)，并將5個(gè)數(shù)據(jù)庫所得靶點(diǎn)取并集。

1.3 藥物-疾病共同靶點(diǎn)確定及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用R語言程序?qū)⑺玫男∠愎椿钚猿煞职悬c(diǎn)與GA疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，取二者交集獲得小香勾治療GA的潛在作用靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。通過可視化分析軟件Cytoscape 3.7.2進(jìn)行“藥物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并利用cytoHubba插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析及核心靶點(diǎn)篩選。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與篩選 將映射所得藥物與疾病的交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)的繪制，并將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，進(jìn)行拓?fù)浞治黾昂诵陌悬c(diǎn)篩選。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析 基于DAVID(https://david.ncifcrf.gov/，DAVID 6.8)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行小香勾治療GA的潛在作用靶點(diǎn)的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，限定物種為人，以篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的主要分子生物過程或信號通路,根據(jù)所得結(jié)果使用R語言繪制條形圖、氣泡圖等。

2 結(jié) 果

2.1 小香勾活性成分信息與作用靶點(diǎn) 通過檢索PubChem數(shù)據(jù)庫，獲得小香勾6個(gè)相關(guān)活性成分的二維及三維結(jié)構(gòu)圖，具體信息見表1。對活性化合物進(jìn)行藥效團(tuán)模型靶點(diǎn)預(yù)測，按標(biāo)準(zhǔn)化得分(normalized fit score)>0.4篩選靶點(diǎn)，共獲得藥物靶點(diǎn)535個(gè)。

表1 小香勾相關(guān)活性成分具體信息

2.2 藥物-疾病共同靶點(diǎn)確定及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 檢索GeneCards、OMI、TTD、Drugbank、PharmGBK共 5個(gè)數(shù)據(jù)庫，最終得到GA相關(guān)疾病靶點(diǎn)414個(gè)。利用R語言程序繪制藥物-疾病交集靶點(diǎn)的韋恩圖(圖1)，可見小香勾治療GA的潛在作用靶點(diǎn)有50個(gè)。

采用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行潛在作用靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)分析。網(wǎng)絡(luò)由56個(gè)節(jié)點(diǎn)、204條邊組成，其中菱形節(jié)點(diǎn)代表小香勾活性成分，橢圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)(圖2)。度值(degree)表示一個(gè)節(jié)點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點(diǎn)的連接次數(shù)，度值越高代表該節(jié)點(diǎn)的中心性越高。通過cytoHubba插件篩選出度值排名前10位的核心作用靶點(diǎn)：MAPK1、SRC、MMP9、PTGS2、MAPK14、MMP3、NOS2、ADAM17、PPARG、PLAU。

圖1 小香勾治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of target proteins for the treatmentof gouty arthritis by Xiaoxianggou

圖2 小香勾活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein interaction network，PIN)的構(gòu)建 將50個(gè)小香勾治療GA的潛在作用靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫中，繪制得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，其中ANK1和SAMHD1與其他靶點(diǎn)間不存在相互作用(圖3)。將得到的互作數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，依據(jù)度值大小篩選出排名前10位的核心作用靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯Y(jié)果如圖4所示，其中節(jié)點(diǎn)顏色越深(紅色)則代表該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的度中心性越高。核心靶點(diǎn)具體蛋白信息見表2。

圖3 靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Targets protein interaction network

表2 核心靶點(diǎn)蛋白具體信息

MAPK1：絲裂原活化蛋白激酶-1；SRC：原癌基因酪氨酸受體激酶；MMPq：基質(zhì)金屬蛋白酶-q；PTGS2：前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶-2；MAPK14：絲裂原活化蛋白激酶-14；NOS2：一氧化氮合酶-2；ADAM17：解整合素金屬蛋白酶-17；PPARG:過氧化物酶體增生激活受體γ；PLAU：尿激酶型纖溶酶原激活劑。圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)Fig.4 Core targets in protein interaction network

2.4 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 對50個(gè)潛在作用靶點(diǎn)的GO功能富集分析結(jié)果見圖5。共得到181個(gè)GO條目數(shù)，其中細(xì)胞組成(cellular component，CC)20條(11.0%)，分子功能(molecular function，MF)43條(23.8%)，生物過程(biological process，BP)118條(65.2%)。限定P<0.05，分別取前10項(xiàng)條目進(jìn)行柱形圖繪制，可見在CC層面上，小香勾對細(xì)胞質(zhì)、溶酶體、細(xì)胞外泌體影響較大；在MF層面上，小香勾對血紅素結(jié)合、藥物結(jié)合、絲氨酸型-內(nèi)肽酶活力影響較大；在BP層面上，小香勾對氧化還原反應(yīng)、藥物反應(yīng)、膠原蛋白分解代謝的過程影響較大。

圖5 基因本體功能富集分析柱形圖Fig.5 Column diagram of gone ontology functional enrichment analysis

KEGG通路富集分析共得到29條相關(guān)信號通路，取排名前10位的通路繪制柱形圖和氣泡圖(圖6)。研究結(jié)果表明，小香勾治療GA的作用主要與能量代謝途徑、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、蛋白聚糖途徑、腫瘤壞死因子信號通路及血管內(nèi)皮長生因子信號通路相關(guān)。

KEGG：基因組百科全書。A:柱形圖；B：氣泡圖。

3 討 論

黃嘌呤氧化酶活性異常增高是痛風(fēng)性相關(guān)疾病的重要誘發(fā)因素之一[7]，LYU等[8]根據(jù)小香勾不同提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制率情況，進(jìn)行藥效物質(zhì)篩選，確定了正丁醇有效部位，并基于HPLC-MS/NMR技術(shù)對小香勾活性成分進(jìn)行分離鑒定，研究結(jié)果提示，小香勾有效部位主要為多酚類物質(zhì)，其中豐度較高的活性化合物為：佛手柑內(nèi)酯、毛地黃黃酮、補(bǔ)骨脂素、蘆丁、羥基香豆素及綠原酸[9]。多酚類化合物因含有大量羥基，使其具有抗氧化、抗炎和鎮(zhèn)痛等多種廣譜藥理活性，目前已成為天然產(chǎn)物研發(fā)熱點(diǎn)之一[10]。本研究通過Pharmmapper數(shù)據(jù)庫對小香勾6個(gè)多酚類活性化合物進(jìn)行藥效團(tuán)模型靶點(diǎn)預(yù)測，在和疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集后共獲得小香勾治療GA的50個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。依據(jù)拓?fù)鋮?shù)分析結(jié)果篩選出的前10位核心靶點(diǎn)中，如MAPK1、MAPK14、PTGS2、NOS2、MMP9等均與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激過程密切相關(guān)。

研究證實(shí)，小香勾醇提液具有較強(qiáng)的DPPH自由基及羥基自由基清除活性，這種清除能力與提取液中的多酚類物質(zhì)含量相關(guān)，尤其是黃酮類和香豆素類化合物的水平，可顯著影響其抗氧化活性[6]。另有文獻(xiàn)表明，小香勾中的多種酚類活性成分均具有不同程度的抗炎作用，如蘆丁通過經(jīng)典炎癥信號通路NF-κB、MAPK等抑制下游炎癥因子的生成[11]，綠原酸可抑制JNK/AP-1通路活化，降低白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的基因表達(dá)[12]。因此，多酚類化合物可能是小香勾發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的關(guān)鍵藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

對小香勾治療GA的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，在代謝途徑的基因富集程度最為顯著，提示小香勾可能通過影響代謝途徑發(fā)揮作用。GO功能富集分析結(jié)果也涉及代謝過程中多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如氧化還原反應(yīng)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸結(jié)合反應(yīng)等。近年來，越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞內(nèi)代謝途徑的改變與細(xì)胞炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[13]。RENAUDIN等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，MSU可以通過誘導(dǎo)NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)活化促進(jìn)巨噬細(xì)胞對葡萄糖的快速吸收，從而驅(qū)動(dòng)糖酵解和炎癥反應(yīng)發(fā)生，而加入抗代謝藥物可抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β分泌水平。不少研究表明，阻斷糖酵解途徑可顯著降低MSU誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，如XUE等[15]利用葫蘆素B處理多種刺激活化后的骨髓巨噬細(xì)胞及小鼠GA模型，發(fā)現(xiàn)糖酵解關(guān)鍵酶下調(diào)，IL-1β生成減少；WU等[16]基于MSU誘導(dǎo)的腹膜炎模型同樣發(fā)現(xiàn)通過毛殼素預(yù)處理可使小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中糖酵解關(guān)鍵酶缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)和NLRP3相關(guān)基因mRNA水平顯著降低。雖然目前尚缺乏充分證據(jù)表明小香勾對細(xì)胞代謝途徑存在直接作用，但不少研究提示，一些多酚類天然產(chǎn)物可通過影響細(xì)胞代謝方式下調(diào)炎癥反應(yīng)，如綠原酸可抑制糖酵解及脂肪酸代謝調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)而減少極化相關(guān)炎性因子IL-6、TNF-α、PTGS2、CXCL-10的表達(dá)水平[17]。另有文獻(xiàn)表明，白藜蘆醇可通過調(diào)控M2-型丙酮酸激酶(pyruvate kinase muscle isoenzyme 2，PKM2)干預(yù)腫瘤細(xì)胞糖酵解途徑，導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少[18]。

在生物過程層面上，小香勾對氧化還原影響較大。研究顯示，除了炎癥過程之外，另一個(gè)與痛風(fēng)有關(guān)的早期事件是氧化應(yīng)激，大量物質(zhì)如吞噬溶酶體、細(xì)胞因子和活性氧(reactive oxygen species，ROS)等在MSU晶體被吞噬的過程中釋放，觸發(fā)關(guān)節(jié)腔內(nèi)的氧化狀態(tài)，并進(jìn)一步導(dǎo)致組織損傷[19-20]。DAI等[21]的研究結(jié)果顯示，小香勾可抑制急性酒精性肝炎小鼠肝臟細(xì)胞中ROS相關(guān)氧化應(yīng)激，同時(shí)促進(jìn)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)生成，從而降低肝臟細(xì)胞的凋亡水平和炎癥反應(yīng)。另有研究表明，小香勾根水提液可顯著降低大鼠血清中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，提高血清中SOD活性[22]，提示小香勾具有一定抗氧化的能力。不少研究也顯示，氧化應(yīng)激可調(diào)控細(xì)胞代謝途徑，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生[23-24]，這也與KEGG分析結(jié)果相一致。此外，花生四烯酸代謝也是KEGG富集分析結(jié)果中較為顯著的通路之一，花生四烯酸的代謝產(chǎn)物如前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)和白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)等被認(rèn)為是痛風(fēng)發(fā)作的重要介質(zhì)，該通路也是傳統(tǒng)抗炎鎮(zhèn)痛藥——NSAIDs發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶通路[25]。LYU等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，小香勾醇提液可抑制GA大鼠血清中TNF-α、PGE2的表達(dá)水平，顯著減輕大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度，提示小香勾可能通過作用于花生四烯酸通路發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用。

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺的建立促進(jìn)了中藥大數(shù)據(jù)挖掘研究的快速發(fā)展，但目前常用的中藥數(shù)據(jù)庫如TCMSP、TCMID等主要收錄傳統(tǒng)中藥品種，對于部分民族特有習(xí)用藥材的收錄缺失，無法滿足民族藥物研究需要。因此，本研究選用靶標(biāo)垂釣平臺Pharmmapper進(jìn)行小香勾化合物靶蛋白篩選。該平臺基于配體特征，通過評估目標(biāo)化合物的藥效團(tuán)與數(shù)據(jù)庫內(nèi)部藥效團(tuán)模型的匹配程度來執(zhí)行預(yù)測，測試結(jié)果表明，該方法可以成功預(yù)測88%化合物的靶點(diǎn)信息[26]。近年來，此類基于化學(xué)信息學(xué)預(yù)測小分子潛在靶點(diǎn)的方法已被廣泛應(yīng)用于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中，為藥物新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)提供了可靠的信息技術(shù)支撐。

本研究結(jié)果表明，小香勾可能通過作用于多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛的功效，且不同靶點(diǎn)之間往往還存在互作關(guān)系，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。筆者將對潛在作用靶點(diǎn)通路進(jìn)行科學(xué)驗(yàn)證，完善小香勾治療GA的藥理和毒理機(jī)制，以促進(jìn)民族藥物小香勾的現(xiàn)代化開發(fā)應(yīng)用。