栝樓桂枝湯通過調節脊髓NMDA受體/KCC2通路改善腦缺血再灌注大鼠肢體功能

鄒俊， 張繼州， 蔣暢， 韓靜

當前，許多疾病都嚴重危害人類的健康，缺血性腦卒中就是其中之一，此類疾病的特點十分顯著，發病率、致殘率以及術后復發率均居高不下[1]，是世界人口死亡的第2個主要因素，是導致長期殘疾的首要因素[2]。肢體痙攣在缺血性腦卒中引起的肢體功能障礙中發生率較高，極大地干擾患側肢體所進行的行為[3]，其發病的主要機制與脊髓運動中樞過度興奮導致的牽張反射亢進有關[4]。當前世界上已經確認用于臨床的抗痙攣藥物有巴氯芬、替扎尼定和丹曲林3種。這些藥物雖然能夠緩解部分肢體痙攣，但隨著治療時間延長，效果均顯著降低[5]，同時存在較多毒副作用，如嗜睡、認知障礙、靜脈血栓等[6]。

《金匱要略》中首次提到栝樓桂枝湯并用來治療外感熱病引起的痙攣等病癥。福建省第二人民醫院運用該方劑治療腦卒中后的肢體痙攣，顯示出較好療效，明確了該方劑柔潤筋脈、解肌止痙等功用[7-8]，并已開發院內制劑。但目前尚未有針對該方劑對卒中后脊髓牽張反射亢進的調節作用以及相關分子機制的研究，缺少作用機制相關資料。據相關研究報道[9]，K+- Cl-共轉運體(KCC2)下調引起細胞內氯離子濃度升高可能是導致運動神經元過度興奮從而引起腦卒中后肢體痙攣發生的重要機制之一；且脊髓運動神經元過度興奮時N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體出現上調。為探究該方劑是否通過NMDA受體/KCC2相關通路參與發揮抗卒中后肢體痙攣的作用，本研究采用神經行為學評價方法，觀察給予栝樓桂枝湯后腦缺血再灌注大鼠肢體功能的康復狀況，采用免疫組織化學染色方法觀察栝樓桂枝湯對脊髓運動神經元的興奮作用，并采用qRT-PCR方法研究栝樓桂枝湯對NMDA受體/KCC2通路蛋白轉錄的影響，探討栝樓桂枝湯調控脊髓相關通路改善肢體痙攣的相關機制，為明確該方調節肢體痙攣的作用機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性SD大鼠36只，體質量(290±10)g，SPF級[上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK (滬)2020-0003]，明暗條件為每日各12 h(光照時間8:00—20:00)，自由飲食飲水。本研究經福建省中醫藥科學院動物倫理委員會審核批準(FJATCM-IAEC2020012)，動物實驗操作嚴格遵循動物相關規定。

1.1.2 試劑 中藥配方顆粒天花粉(200605)、桂枝(200311)、芍藥(200123)、甘草(200104)、大棗(200104)(北京康仁堂藥業有限公司)；兔抗KCC2抗體(貨號：ab49917)、兔抗c-fos抗體(貨號：ab190289)、兔抗NMDAR1抗體(貨號：ab68144)、兔抗NMDAR2A抗體(貨號：ab169873)、兔抗NMDAR2B抗體(貨號：ab73001)(英國Abcam公司)；即用型快捷免疫組化MaxVision 2 HRP試劑盒(鼠/兔)(貨號：2009175920D，福州邁新生物技術開發有限公司)；分子生物級超純水(貨號：SH30538.02，美國HyClone公司)；RNA提取液(貨號：G3013)、Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit(貨號：G3330)、2×SYBR Green qPCR Master Mix (none ROX)(貨號：G3320)(武漢賽維爾生物科技有限公司)；異氟烷(R510-22-16，深圳瑞沃德生命科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠局灶性腦缺血再灌注模型 采用線栓法制作大腦中動脈缺血再灌注模型[10]。動物在異氟烷氣體吸入麻醉下進行手術，對其頸部的正中心切口，鈍性分離頸內動脈(internal carotid artery，ICA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸總動脈(common carotid artery，CCA)；分別電凝甲狀腺上動脈和枕動脈。距CCA分叉約10 mm處結扎ECA近心端，電凝阻斷遠心端。暫時性封閉CCA，將MCAO線栓從ECA殘端相距CCA叉口約5 mm處暴露的小切口插入ICA，線栓首端距CCA分叉處約20 mm時，進栓出現輕微的阻力，此時為線栓剛好進入大腦的前動脈，封堵大腦中動脈的開口，MCAO模型制作完成。造模2 h后，動物在異氟烷氣體麻醉下拔出線栓并結扎ECA殘端。術后20～25 ℃條件下飼養大鼠，自由飲食飲水。假手術組除去ICA進線栓步驟外，其余步驟和上述均一致。模型制作后按照Longa神經功能缺失標準(五分制)[11]進行神經功能評分，1～3分代表建模成功。具體細則制定如下：神經缺陷所導致癥狀不明顯或沒有，行為正常為0分；抬起大鼠尾部時，左前肢缺少伸展動作為1分；大鼠整個軀體活動時出現偏好患側旋轉為2分；大鼠出現無法控制的軀干傾斜為3分；無法進行自主行走或處于重度昏迷狀態為4分。

1.2.2 中藥顆粒配制及動物分組給藥 采用天花粉30 g、桂枝9 g、芍藥9 g、甘草6 g、生姜9 g和大棗9 g標準配方顆粒配制栝樓桂枝湯。量取120 mL去離子水加熱至沸騰，加入一劑栝樓桂枝湯顆粒劑，用玻璃棒攪拌均勻，在100 ℃沸水浴中沖泡混合作用30 min，緩慢冷卻至室溫。根據動物體表面積等效劑量換算，大鼠灌胃劑量是成人臨床劑量的5倍[12]，即生藥量6 g/kg。按照1.2.1的方法對SD大鼠進行造模，術后第1天進行Longa法評分。選取造模成功的大鼠36只，利用隨機數字進行完全隨機分組，模型組、栝樓桂枝湯組及假手術組各12只。栝樓桂枝湯組于分組后，立刻進行灌胃，每只均依照體質量給予等量湯劑(1 mL/100 g)，持續給藥7 d，每日1次，其余組別均給予等量生理鹽水。

1.2.3 動物神經行為學評價 在第3天和第7天對分組后的大鼠進行神經行為學評分，具體標準分以下兩個部分：改良型神經缺損等級評分(modified neurological severity score，mNSS)和平衡木測試(beam balance test，BBT)。

1.2.3.1 mNSS 評分 參照文獻[13]，通過包含感覺、反射、運動以及平衡標準的改良型神經缺損等級進行評分。重度神經功能缺失為10～14分；普通神經功能缺失為6～9分；輕微神經功能障礙為1～5分；表現正常為0分。

1.2.3.2 BBT評分 主要考察動物在特定運動下的協調和平衡功能，取一根長45 cm、寬2 cm、距離實驗臺面40 cm的特質塑料條，將動物放在上面，檢測動物的活動情況并計時。具體評分細則[14]如下：有較強的平衡感并持續保持為0分；平衡感稍好但始終保持緊張并抓緊塑料條為1分；可抓緊塑料條但出現一爪無力垂下狀態為2分；可抓緊塑料條但出現二爪無力垂下狀態或出現旋轉(t>60 s)為 3分；努力嘗試保持穩定但落下(40 s≤t≤60 s)為4分；努力嘗試保持穩定但落下(20 s≤t<40 s)為5分；努力嘗試保持穩定但落下或無法抓穩(t<20 s)為6分。大鼠的神經功能缺失越多則評分越高。

1.2.4 免疫組織化學染色及圖像分析 在第7天行為學評價結束后，每組各取6只動物，用10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉，經心臟灌注4%多聚甲醛和生理鹽水固定；待固定完全，斷頭取出脊髓的頸膨大部位，以20%、30%蔗糖進行梯度脫水，OTC包埋后進行厚度為30 μm的連續冠狀冰凍切片。采用漂片法對脊髓冰凍切片進行c-fos、KCC2及NMDA受體各亞型染色。切片經PBS漂洗，在3%的過氧化氫中，進行10 min的室溫孵育，后再次經PBS漂洗，在兔多克隆c-fos抗體(1∶5 000)、兔多克隆KCC2抗體(1∶3 000)、兔多克隆NMDAR1抗體(1∶400)、兔多克隆NMDAR2A抗體(1∶1 000)、兔多克隆NMDAR2B抗體(1∶250)中4 ℃過夜孵育。經PBS漂洗，隨后在新型酶標聚合物(羊抗小鼠/兔IgG)中室溫孵育15 min，洗片；后在DAB顯色液中顯色10 min。最后將切片在玻片中鋪平，在二甲苯中透明，用中性樹膠封片，在倒置顯微鏡20倍下進行觀察并拍照。每只動物均拍攝2張脊髓片，選取2個不重復的隨機連續視野，采用Image J 1.50圖像分析軟件進行半定量計算分析測定脊髓前角目的標記物。

1.2.5 qRT-PCR檢測及定量分析 在第7天行為學評價結束后，每組各取6只動物，采用10%水合氯醛對其腹腔注射麻醉，取出脊髓的頸膨大部位。采用TRIzol法提取總RNA，先用Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄得到cDNA，然后用2×SYBR Green qPCR Master Mix(none ROX)試劑盒，采用qRT-PCR檢測NMDA受體各亞型(NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B)以及KCC2 mRNA的表達水平。通過2-ΔΔCT法進行相對定量并分析。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR的引物

2 結 果

2.1 栝樓桂枝湯對缺血再灌注大鼠神經行為學評分的影響 腦缺血再灌注3 d開始，與假手術組比較，模型組大鼠的肢體功能發生障礙，mNSS評分顯著升高(P<0.01)；給予栝樓桂枝湯治療7 d后，與模型組比較，栝樓桂枝湯組mNSS評分顯著降低，肢體功能明顯改善(P<0.05，圖1A)。獨立觀察平衡木測試(圖1B)，模型組較假手術組評分升高，差別有統計學意義(P<0.01)，給予栝樓桂枝湯治療 7 d 后評分降低，與模型組比較，差別有統計學意義(P<0.01)。

2.2 栝樓桂枝湯對缺血再灌注大鼠脊髓神經細胞c-fos及KCC2表達水平的影響 免疫組織化學染色觀察，神經細胞興奮性標記物c-fos集中于脊髓前角，模型組雙側神經細胞興奮性標記物免疫陽性染色在患側較健側顯著加深，表達水平的比值(患側/健側)模型組較假手術組升高，差別有統計學意義(P<0.01)，患側較健側免疫陽性染色顯著加深；給予栝樓桂枝湯后脊髓前角c-fos表達水平比值較模型組降低，差別有統計學意義(P<0.01，圖2A，圖3A)。模型組KCC2的免疫陽性染色在患側較健側顯著淡化，與假手術組比較，其表達水平的比值(患側/健側)降低，差別有統計學意義(P<0.01)；給予栝樓桂枝湯后表達水平較模型組升高，差別有統計學意義(P<0.01，圖2B，圖3B)。

n=12。SH：假手術組；M：模型組；GL：栝樓桂枝湯給藥組；mNSS評分：改良型神經缺損等級評分；BBT：平衡木測試。A：mNSS評分；B：BBT評分。與假手術組比較，##：P<0.01；與模型組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01。圖1 栝樓桂枝湯對大鼠mNSS和Beam Balance的影響Fig.1 Effects of Gualou Guizhi Decoction on mNSS and Beam Balance in rats

SH：假手術組；M：模型組；GL：栝樓桂枝湯給藥組。A：c-fos；B：KCC2。圖2 各組大鼠脊髓雙側c-fos和KCC2表達水平的差異( ×20)Fig.2 Differences in the expression levels of bilateral c-fos and KCC2 in the spinal cord of rats in each group( ×20)

n=6。SH：假手術組；M：模型組；GL：栝樓桂枝湯給藥組。A：c-fos；B：KCC2。與假手術組比較，##：P<0.01；與模型組比較，☆☆：P<0.01。圖3 栝樓桂枝湯對大鼠脊髓雙側c-fos和KCC2表達水平比值的影響Fig.3 The effect of Gualou Guizhi Decoction on the expression ratio of bilateral c-fos and KCC2 in rat spinal cord

2.3 栝樓桂枝湯對缺血再灌注大鼠脊髓NMDA受體各亞型表達水平的影響 免疫組織化學染色觀察，模型組NMDA受體各亞型的免疫陽性染色在患側較健側顯著加深，與假手術組比較，其表達水平的比值(患側/健側)升高，差別有統計學意義(P<0.01)；給予栝樓桂枝湯后表達水平較模型組降低，差別有統計學意義(P<0.01，圖4，圖5)。

SH：假手術組；M：模型組；GL：栝樓桂枝湯給藥組。A：NMDAR1；B：NMDAR2A；C：NMDAR2B。圖4 各組大鼠脊髓雙側NMDA受體各亞型表達水平的差異( ×20)Fig.4 Differences in the expression levels of various subtypes of NMDA receptors in bilateral spinal cords of rats in each group( ×20)

2.4 栝樓桂枝湯對缺血再灌注大鼠脊髓NMDA受體各亞型及KCC2 mRNA表達水平的影響 qRT-PCR結果顯示(圖6A)，模型組較假手術組脊髓NMDA受體的各亞型(NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B)的mRNA表達水平上升，差別有統計學意義(P<0.01)，給予栝樓桂枝湯后mRNA表達水平較模型組降低，差別有統計學意義(P<0.01)；模型組較假手術組KCC2的mRNA表達水平降低，差別有統計學意義(P<0.01)，給予栝樓桂枝湯后mRNA表達水平較模型組顯著升高(P<0.01，圖6B)。

n=6。SH：假手術組；M：模型組；GL：栝樓桂枝湯給藥組。與假手術組比較，##：P<0.01；與模型組比較，☆☆：P<0.01。圖5 栝樓桂枝湯對大鼠脊髓雙側NMDA受體各亞型表達水平比值的影響Fig.5 Effects of Gualou Guizhi Decoction on the ratio of expression levels of various subtypes of NMDA receptors in the bilateral spinal cord of rats

n=6。SH：假手術組；M：模型組；GL：栝樓桂枝湯給藥組。A：NMDA受體各亞型mRNA表達水平；B：KCC2 mRNA表達水平。與假手術組比較，##：P<0.01；與模型組比較，☆☆：P<0.01。圖6 栝樓桂枝湯對大鼠NMDA受體各亞型mRNA及KCC2 mRNA表達水平的影響Fig.6 Effects of Gualou Guizhi Decoction on the expression levels of NMDA receptor subtype mRNA and KCC2 mRNA in rats

3 討 論

本研究采用mNSS和BBT等神經行為學測定方法對腦缺血再灌注大鼠進行行為活動和肢體功能的評價[15]。從神經行為學的表現分析，給予栝樓桂枝湯的第3天開始，肢體功能逐漸恢復；于第7天出現顯著性差異，大鼠的肢體痙攣癥狀和軀干協調性出現明顯好轉。結果表明栝樓桂枝湯可顯著改善腦缺血所致的神經功能障礙，對肢體痙攣起到較好的緩解作用。

缺血性腦卒中發生后，脊髓上部中樞(錐體束等)受損，導致脊髓運動中樞的抑制作用消失，引起α運動神經元過度興奮從而導致牽張反射亢進，這是卒中后肢體痙攣發生的主要原因[4]。c-fos是一種即刻早期基因，在神經細胞的發育、分化、再生修復等情況下均有表達，可作為神經細胞興奮性標記物[16]。研究表明[17-18]，在大鼠出現缺血再灌注損傷后，脊髓運動神經元中c-fos表達增加，在一定程度上反映了脊髓運動神經元異常激活的情況。本研究對神經細胞興奮性標記物c-fos進行免疫組織化學染色，結果顯示，與假手術組比較，大鼠發生腦缺血損傷后脊髓前角c-fos的表達顯著升高，給予栝樓桂枝湯治療后，c-fos的表達出現顯著降低，提示該方對卒中后脊髓運動神經元興奮性產生抑制作用，對卒中后肢體痙攣起到緩解作用。

近年，相關研究表明，有一類陽離子-氯離子共轉運體參與了脊髓前角運動神經元興奮性調節[19]；且在整個神經系統中，細胞內氯離子濃度發生變化時，神經傳遞(γ-氨基丁酸介導)的方向和強度都會受到影響[20]，其中促進氯離子外排的轉運體KCC2是研究的重點和方向。KCC2的免疫染色及mRNA表達水平檢測結果顯示，模型組較假手術組KCC2下降；提示腦缺血再灌注大鼠出現神經興奮性增強及脊髓牽張反射功能亢進同時伴隨KCC2的下調相關。在給予栝樓桂枝湯治療后，發現腦缺血損傷導致的KCC2下調明顯恢復；表明栝樓桂枝湯可作用于脊髓前角，參與調控KCC2。

研究表明，在腦缺血再灌注損傷的大鼠中，NMDA受體激活將導致KCC2功能下調[21]。本研究進一步探究NMDA是否參與了栝樓桂枝湯調節卒中后肢體痙攣的相關機制，與KCC2的表達是否存在聯系。本研究進行了脊髓前角NMDA受體各亞型免疫組織化學染色和mRNA表達水平的檢測，結果顯示，模型組NMDA受體各亞型的表達較假手術組顯著升高，給予栝樓桂枝湯后顯著降低，表明NMDA受體參與栝樓桂枝湯緩解腦缺血后肢體痙攣的機制；結合KCC2免疫組織化學及mRNA表達水平的檢測結果，NMDA受體的上調和KCC2表達水平的下調共同參與了卒中后肢體痙攣產生的機制，與文獻報道一致；給予栝樓桂枝湯后NMDA受體發生下調，KCC2的下調得以恢復，兩者的變化存在一定關聯。但在栝樓桂枝湯的作用下，NMDA受體是如何調控KCC2并共同參與調節卒中后肢體痙攣等問題還有待進一步研究。

近年來，栝樓桂枝湯對腦缺血損傷的神經保護作用機制的基礎研究主要集中在對腦組織神經炎癥的抑制[22-23]、抑制凋亡促進軸突及功能的重塑[1, 24]等機制的探討，同時，相關研究還顯示，該方降低了腦組織AMPA和NMDA谷氨酸受體蛋白的表達[25]，增加GABA受體mRNA和蛋白表達[26]。然而，這些研究均未涉及對腦缺血后脊髓牽張反射亢進的調節作用以及分子機制的研究。本研究首次報道了栝樓桂枝湯調控脊髓NMDA受體及其下游KCC2蛋白，降低脊髓前角運動神經細胞興奮性的作用，從新的視角為栝樓桂枝湯應用于臨床肢體痙攣提供一定的理論依據；但本研究尚未確定不同劑量栝樓桂枝湯對缺血再灌注損傷大鼠肢體功能的影響，具體量效關系仍需進一步探究，后續將進一步補充實驗，研究該問題。