FGF1通過miR-150對高糖誘導(dǎo)的HK-2人腎小管上皮細(xì)胞凋亡及纖維化因子表達(dá)的影響

任欣會， 原霞

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是嚴(yán)重的糖尿病合并癥，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因(占30%～47%)[1-2]。DN的病理特征是細(xì)胞外基質(zhì)和蛋白質(zhì)[包括纖連蛋白(fibronectin, FN)和膠原蛋白(collagen)]的積累，腎小球膜增厚以及進(jìn)行性系膜肥大[3]。高血糖引起的代謝損傷對DN的發(fā)展至關(guān)重要[1]，DN引起的腎功能障礙與腎小球系膜和腎小管間質(zhì)的細(xì)胞外間質(zhì)沉積，最終導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化[4-5]。目前針對DN的治療方法有限。因此，進(jìn)一步明確DN發(fā)病的分子機(jī)制，篩選DN的候選治療靶點(diǎn)，具有重要臨床意義。

成纖維細(xì)胞生長因子1(fibroblast growth factor 1, FGF1)屬于FGF家族之一，參與細(xì)胞的有絲分裂調(diào)節(jié)，在冠心病、心肌缺血、神經(jīng)損傷和傷口愈合等方面均發(fā)揮作用[6]。FGF1還能通過調(diào)節(jié)葡萄糖及脂質(zhì)代謝，參與肥胖和糖尿病的調(diào)節(jié)[7-8]；可通過調(diào)控氧化應(yīng)激、炎癥因子釋放、單核苷酸多態(tài)性等抑制DN的發(fā)生[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF1的表達(dá)受微小RNA(microRNA, miRNA)的調(diào)控，影響心肌纖維化[12]、肺纖維化[13]；異常表達(dá)的非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)，特別是miRNA與DN的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，可作為DN的診斷標(biāo)志物[14]。通過基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression ominibus, GEO)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF1在DN中顯著下調(diào)，hsa-miR-150在DN中顯著上調(diào)；抑制miR-150的表達(dá)可顯著改善慢性腎病及腎纖維化損傷[15]。FGF1是否通過miR-150的表達(dá)影響高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞凋亡及纖維化，目前還未見報(bào)道。因此，本研究擬構(gòu)建HK-2細(xì)胞高糖損傷模型，觀察FGF1對HK-2細(xì)胞凋亡及纖維化的影響及其與hsa-miR-150表達(dá)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒、RIPA細(xì)胞快速裂解液、BCA試劑盒及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(武漢靈思生物技術(shù)有限公司)；MEM/F12培養(yǎng)基、無糖MEM/F12培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(美國Gibco公司)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox Plus)(上海捷瑞生物工程有限公司)；兔抗FN抗體、兔抗collagen Ⅰ(Col-1)抗體、兔抗collagen Ⅳ(Col-4)抗體及兔抗轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)抗體(英國Abcam公司)；GAPDH及HRP酶標(biāo)抗兔二抗(武漢Proteintech公司)；hsa-miR-150 mimics、hsa-miR-150 inhibitor及miRNA-NC(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)；pCDNA3.1-FGF1及pRL-TK- FGF1(WT)、pRL-TK- FGF1(MUT)表達(dá)載體(武漢靈思生物技術(shù)有限公司)。qRT-PCR 引物序列如表1， 序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 GEO數(shù)據(jù)分析 選擇GEO數(shù)據(jù)(GSE1009[16]、GSE51674[17])，利用GEO2R篩選差異基因[篩選標(biāo)準(zhǔn)：|log2Fold Change|(|log2FC|)> 1，P<0.05]；利用starbase 3.0分析FGF1與hsa-miR-150結(jié)合關(guān)系。

1.2.2 高糖損傷模型構(gòu)建 HK-2細(xì)胞復(fù)蘇后，待其黏合度達(dá)90%以上時(shí)，參考文獻(xiàn)[5,18]的方法，將HK-2細(xì)胞分組：NG組(含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng))、OS組(含5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基培養(yǎng))、HG組(含25.0 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng))，連續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 參照脂質(zhì)體Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明書，采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將pCDNA3.1-FGF1、pCDNA3.1-vector分別與hsa-miR-150 inhibitor共轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞6 h 后，按照1.2.2構(gòu)建高糖損傷模型。

1.2.4 細(xì)胞活力檢測 收集細(xì)胞，按照試劑盒操作說明，每孔加入10 μL CCK-8溶液， 在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5 h，用酶標(biāo)儀(450 nm)檢測各組細(xì)胞的光密度(optical density，OD)。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測 收集細(xì)胞，按照試劑盒操作說明， 冰乙醇固定后，加入10 μL Annexin V-FITC及碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，NovoExpressTM分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 qRT-PCR檢測 收集細(xì)胞，TRIzol裂解提取RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，進(jìn)行qRT-PCR檢測。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s→52 ℃ 15 s→72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；65 ℃ 10 s→95 ℃ 40 s。以GAPDH或U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.2.7 Western-blot檢測 收集細(xì)胞，中度RIPA裂解，冰上孵育20 min后，4 ℃、10 000×g離心3～5 min，取上清，獲得全蛋白，BCA定量后，按照每孔20 μg蛋白量上樣，SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，分別以兔抗FN抗體(1∶1 000)、兔抗Col-1抗體(1∶600)、兔抗Col-4抗體(1∶800)、兔抗TGF-β1(1∶1 000)及兔抗GAPDH(1∶10 000) 4 ℃ 孵育過夜后，PBST漂洗3～5次，加入HRP酶標(biāo)抗兔二抗。加入ECL發(fā)光液后，將NC膜置于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中掃描，通過TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

目的蛋白的表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參GAPDH的灰度值

2 結(jié) 果

2.1 高糖刺激促進(jìn)HK-2細(xì)胞凋亡及纖維化相關(guān)因子表達(dá) 與NG組比較，HG組抑制HK-2細(xì)胞活力(t=4.65，P<0.01)，促進(jìn)HK-2細(xì)胞凋亡(t=14.73，P<0.01)。Western-blot檢測結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組能夠顯著增加Col-1(t=10.38，P<0.01)、Col-4(t=9.43，P<0.01)、FN(t=10.25，P<0.01)及TGF-β1(t=9.34，P<0.01)的表達(dá)。具體見圖1。

2.2 高糖對FGF1及has-miR-150表達(dá)的影響 利用GEO2R分析GSE1009數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與NG組比較，DN患者腎小球中52個(gè)基因發(fā)現(xiàn)顯著變化，其中上調(diào)16個(gè)，下調(diào)36個(gè)，F(xiàn)GF1下調(diào)倍數(shù)為|log2FC|=3.74。GSE51674中，與NG組比較，DN引起腎纖維化患者腎組織中777個(gè)miRNA 表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中上調(diào)197個(gè)，下調(diào)580個(gè)，has-miR-150上調(diào)倍數(shù)為|log2FC|=7.89。Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，高糖抑制HK-2細(xì)胞中FGF1蛋白表達(dá)(t=9.62，P<0.01)。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，高糖能夠顯著抑制HK-2細(xì)胞中FGF1表達(dá)(t=5.07，P<0.01)，但促進(jìn)has-miR-150的表達(dá)(t=21.86，P<0.01)。直線回歸分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF1的表達(dá)與has-miR-150的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。具體見圖2。

NG：5.5 mmol/L葡萄糖；OS：5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇；HG：25.0 mmol/L葡萄糖。FN：纖連蛋白；Col:膠原蛋白；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子β1。A：CCK-8檢測細(xì)胞活力；B、C：細(xì)胞凋亡檢測；D：Western-blot檢測纖維化指標(biāo)表達(dá)。NG組與HG組比較，☆☆:P<0.01。圖1 高糖刺激后HK-2細(xì)胞凋亡及纖維化指標(biāo)檢測Fig.1 HK-2 cell apoptosis and fibrosis were detected after high glucose stimulation

2.3 HK-2細(xì)胞中FGF1調(diào)控miR-150表達(dá) pCDNA3.1-FGF1、pCDNA3.1-vector分別利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入HK-2細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞檢測，結(jié)果顯示，pCDNA3.1-FGF1顯著促進(jìn)FGF1 mRNA(t=12.09，P<0.01)及蛋白水平(t=6.37，P<0.01)的表達(dá)；但FGF1過表達(dá)后，miR-150的表達(dá)被顯著抑制(t=7.24，P<0.01)。分別將miR-150 mimics、inhibitor轉(zhuǎn)染入HK-2細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與NG組比較，miR-150 mimics能夠顯著促進(jìn)miR-150的表達(dá)(t=8.26，P<0.01)，而miR-150 inhibitor顯著抑制miR-150的表達(dá)(t=5.00，P<0.01)；qRT-PCR檢測FGF1 mRNA的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與 NG組比較，miR-150 mimics及inhibitor對FGF1的表達(dá)無顯著變化(t=0.25，P=0.82；t=0.47，P=0.66)；Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，miR-150 mimics及inhibitor對FGF1蛋白的表達(dá)亦無顯著變化(t=0.75，P=0.49；t=0.49，P=0.65)。具體見圖3。

DN：糖尿病腎?。籆ontrol：正常腎組織；NG：5.5 mmol/L葡萄糖；OS：5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇；HG：25.0 mmol/L葡萄糖。FGF1：成纖維細(xì)胞生長因子。A～B：GEO2R分析；C～D：Western-blot檢測FGF1蛋白表達(dá)；E：qRT-PCR檢測FGF1 mRNA表達(dá)；F：qRT-PCR檢測miR-150表達(dá)；G：FGF1與miR-150表達(dá)相關(guān)性分析。與另兩組比較，☆☆：P<0.01。圖2 高糖對FGF1及has-miR-150表達(dá)的影響Fig.2 The effect of high glucose on the expression of FGF1 and has-miR-150

2.4 FGF1通過miR-150參與高糖所導(dǎo)致的HK-2細(xì)胞凋亡 與HG組比較，F(xiàn)GF1過表達(dá)后，能顯著促進(jìn)HK-2細(xì)胞活力(t=6.47，P<0.01)，降低HG所導(dǎo)致的HK-2細(xì)胞凋亡(t=4.93，P<0.01)；與FGF1過表達(dá)相比，抑制miR-150的表達(dá)后，進(jìn)一步促進(jìn)HK-2細(xì)胞活力(t=4.01，P=0.02)，降低HK-2細(xì)胞凋亡(t=8.42，P<0.01，圖4)。

2.5 FGF1通過miR-150參與高糖引起的HK-2細(xì)胞纖維化 通過Western-blot檢測纖維化相關(guān)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)：與HG組比較，F(xiàn)GF1過表達(dá)后，能夠顯著抑制Col-1(t=4.97，P<0.01)、Col-4(t=4.74，P<0.01)、FN(t=6.49，P<0.01)及TGF-β1(t=5.07，P<0.01)的表達(dá)；與FGF1過表達(dá)比較，miR-150 inhibitor進(jìn)一步抑制Col-1(t=9.48，P<0.01)、Col-4(t=9.03，P<0.01)、FN(t=6.49，P<0.01)及TGF-β1(t=6.03，P<0.01)的表達(dá)(圖5)?？梢奆GF1抑制高糖所致HK-2細(xì)胞纖維化與miR-150的表達(dá)被抑制相關(guān)。

FGF1：成纖維生長因子。Control(1)：空白對照組；Empty-vector(2)：轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-vector；OV-FGF1(3)：轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-FGF1表達(dá)載體；miRNA-NC(4)、miRNA-mimics(5)、miRNA-inhibitor(6)分別代表無關(guān)序列、miR-150模擬物、miR-150抑制劑。A：qRT-PCR檢測FGF1表達(dá)；B：qRT-PCR檢測miR-150表達(dá)；C～F：Western-blot檢測FGF1表達(dá)；G：qRT-PCR檢測miR-150表達(dá)；H：qRT-PCR檢測FGF1表達(dá)。與Control組比較，☆☆：P<0.01。圖3 FGF1影響miR-150表達(dá)Fig.3 FGF1 inhibits miR-150 expression

FGF1：成纖維細(xì)胞生長因子。Control(1)：空白對照組；Empty-vector(2)：轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-vector；OV-FGF1(3): 轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-FGF1表達(dá)載體；miR-inhibitor(4)：轉(zhuǎn)染 miR-150抑制劑；OV-FGF1+ miR-inhibitor(5)：同時(shí)轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-FGF1表達(dá)載體及miR-150抑制劑。A:CCK-8檢測細(xì)胞活力；B、C：細(xì)胞凋亡檢測。組間比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01。圖4 FGF1/miR-150參與高糖對HK-2細(xì)胞凋亡Fig.4 FGF1/miR-150 participated in the effect of high glucose on HK-2 cell apoptosis

HG：25.0 mmol/L葡萄糖；Empty-vector：轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-vector；OV-FGF1：轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-FGF1表達(dá)載體；miR-inhibitor：轉(zhuǎn)染miR-150抑制劑。FN：纖連蛋白；Col:膠原蛋白；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子β1。A：Western-blot檢測纖維化指標(biāo)(Col-1、Col-4、FN和TGF-β1)表達(dá)；B～E：纖維化指標(biāo)表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。組間比較，☆☆：P<0.01。圖5 Western-blot檢測HK-2細(xì)胞纖維化相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)Fig.5 Expression of HK-2 cell fibrosis related protein detected by Western-blot

3 討 論

糖尿病是一種常見的慢性代謝性疾病，已經(jīng)影響了全球約10億人，生存環(huán)境及生活方式的改變均會導(dǎo)致糖尿病的發(fā)病率增加。國際糖尿病聯(lián)合會(International Diabetes Federation，IDF)預(yù)計(jì)，到2045年，糖尿病患者的人數(shù)將增加至7.83億，糖尿病不僅影響患者身體健康，還會增加全球性的社會負(fù)擔(dān)，尤其是在中低收入國家[19]。DN是嚴(yán)重的糖尿病合并癥，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因(占30%～47%)[1-2]。腎小球系膜細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)和蛋白質(zhì)的積累是其主要病理特征[3]，腎小管上皮細(xì)胞損傷是促使終末期腎病發(fā)生的重要原因之一。高糖刺激下，抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，促進(jìn)TGF-β1、FN、Col-1等纖維化標(biāo)志因子表達(dá)[20-21]，最終導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化[4-5]，導(dǎo)致不可逆的終末期腎功能衰竭。

近年研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF1及其衍生物能夠使糖尿病小鼠的血糖快速恢復(fù)至正常水平，且具有胰島素增敏效果，規(guī)避胰島素治療產(chǎn)生的耐受性問題[22]。FGF1可通過抑制NF-κB的活化而抑制炎癥的產(chǎn)生[23]；通過抑制氧化應(yīng)激，阻滯高糖所導(dǎo)致的活性氧、一氧化氮合成酶、血管生長因子及血管緊張素的產(chǎn)生[24]。FGF1能夠顯著改善高糖所導(dǎo)致的腎纖維化和腎小球硬化，阻滯腎臟誘導(dǎo)的collagen和TGF-β1的表達(dá)，進(jìn)而起到保護(hù)DN的作用[23,25-26]。TGF-β1是纖維化的主要調(diào)節(jié)因子[27]，通過刺激多種纖維化分子(例如collagen)誘導(dǎo)DN腎纖維化[28]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，在DN中，F(xiàn)GF1的表達(dá)顯著降低；HK-2細(xì)胞過表達(dá)FGF1后，可顯著降低高糖所導(dǎo)致的HK-2細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞活力，降低纖維化相關(guān)標(biāo)志物Col-1、Col-4、FN及TGF-β1的表達(dá)。

研究表明，miRNA的異常表達(dá)參與DN的發(fā)生及進(jìn)展，可作為DN的早期診斷標(biāo)志物，如miR-21、miR-29a、miR-29b和miR-29c[14]。miR-150的異常表達(dá)參與心肌、肝臟及腎臟纖維化的發(fā)生[15,29-31]。那么，F(xiàn)GF1參與腎纖維化的保護(hù)作用是否與miR-150 的表達(dá)相關(guān)？本研究檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF1過表達(dá)后，能夠顯著抑制HK-2細(xì)胞中miR-150的表達(dá)；而過表達(dá)和抑制miR-150的表達(dá)，并不影響HK-2細(xì)胞中FGF1的表達(dá)。miRNA發(fā)揮作用的最常見方式是抑制靶基因的3’-UTR。前期通過miRDB、TargetScan 7.2、starbase 3.0及RegRNA 2.0等數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-150與FGF1 3’-UTR并無結(jié)合位點(diǎn)。FGF家族可通過調(diào)控某些轉(zhuǎn)錄因子或結(jié)合miRNA啟動子，進(jìn)而影響miRNA的表達(dá)。FGF-2可通過激活NDY1(not dead yet-1)，促使NDY1與miR-101的啟動子結(jié)合，抑制miR-101的表達(dá)，解除miR-101對zeste同源物2增強(qiáng)子(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和血管生成[32]。FGF-2可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子FOS相關(guān)抗原1(Fos-related antigen 1, FRA-1)的表達(dá)，導(dǎo)致FRA-1與miR-29a啟動子中保守區(qū)域AP-1位點(diǎn)元件結(jié)合，調(diào)控miR-29a/SPARC軸的表達(dá)，影響骨骼肌中的脂肪沉積[33]。FGF1是否發(fā)揮類似的功能，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，F(xiàn)GF1可通過miR-150參與高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡及纖維化的調(diào)節(jié)。但FGF1對miR-150調(diào)控機(jī)制以及具體影響的下游靶基因還需深入探討；同時(shí)，本研究僅限于細(xì)胞層面，后續(xù)還需從動物和臨床水平進(jìn)一步明確FGF1及miR-150調(diào)控DN的具體作用機(jī)制，明確miR-150作為DN的診斷標(biāo)志物的可能性。