人參皂苷Rg1對寡聚態Aβ1-42增加p38絲裂原活化蛋白激酶活性誘導神經元損傷的可能影響

何饒麗， 林楠， 方麗君， 黃天文，

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種以進行性認知障礙為主要臨床特征的神經系統退行性疾病，常見于老年人。調查顯示，目前全球約有5 000萬AD患者，我國老年人的AD患病率為3%～7%[1]，給家庭和社會帶來了巨大負擔。寡聚態β-淀粉樣蛋白1-42(amyloidβ-protein 1-42, Aβ1-42)作為AD發病機制的Aβ瀑布學說中毒性最大的片段，在AD的發病中起重要的作用。在AD患者的腦組織及Aβ的毒性機制中發現，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)的功能異常激活是其重要的病理生理機制。因此，p38 MAPK被認為是治療AD的重要潛在靶點之一[2]。

近年來，傳統中醫藥在AD防治中的作用備受關注。人參作為我國傳統的名貴中藥，具有悠久的應用歷史，包含多種成分，其主要成分之一是人參皂苷Rg1，屬三醇苷，具有較強的生物學活性。本課題組前期研究證實，人參皂苷Rg1可能通過多種途徑減輕Aβ1-42誘導的神經元凋亡，從而達到防治AD的作用[3-4]。在此基礎上，本研究在Aβ1-42誘導的AD細胞模型進一步探討人參皂苷Rg1對p38 MAPK信號轉導通路的分子作用機制，以期為人參皂苷Rg1防治AD提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級C57BL/6孕鼠(孕齡15～16 d，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)。

1.1.2 主要試劑和儀器 寡聚態Aβ1-42(美國康薩斯大學嚴世都教授惠贈)；人參皂苷Rg1(純度>98%，吉林大學基礎醫學院有機化學教研室)；β-actin單克隆抗體(美國NeoMarkers公司)；磷酸化神經絲多克隆抗體(MAB1592，美國Millipore公司)；多克隆抗體p38 MAPK、鼠單克隆抗體phospho-p38 MAPK(Thr180/182)(美國Cell Signaling Technology公司)；胎牛血清(杭州江濱生物技術有限公司)；Neurobasal培養基(美國Gibco公司)；Western-blot化學發光檢測試劑盒(美國KPL公司)；TUNEL測定試劑盒(美國Trevigen公司)；caspase-3活性檢測試劑盒(美國Clontech Laboratories公司)。細胞裂解液：Tris(pH值7.4，10 μmol/L)+ Na4P2O7(20 μmol/L)+ Na3VO4(2 μmol/L)+ NaCl (100 μmol/L)+乙二胺四乙酸 (EDTA)(1 μmol/L)+乙二醇雙四乙酸(EGTA)(1 μmol/L)+NaF(1 μmol/L)+SDS(0.1%)+PMSF(1 μmol/L)+Sodium deoxycholate(0.5%)+Triton-X 100(1%)+抑酶肽(60 μmol/L)+亮抑酶肽(10 μmol/L)+胃蛋白酶抑制劑(1 μmol/L)。解剖小鼠腦組織的溶液：Neurobasal培養基+2 mol/L的L-谷氨酰胺+2%的B27+4.4 mmol/L的NaHCO3；皮質神經元基礎培養基：Neurobasal培養基+0.1 IU/L的青霉素G+0.1 IU/L的鏈霉素+1.19 g/L的HEPES+2 g/L的NaHCO3；皮質神經元生長培養基：Neurobasal培養基+50 U/mL的青霉素+50 U/mL的鏈霉素+2 mol/L的L-谷氨酰胺+2%的B27。倒置顯微鏡(CK40型，日本Olympus公司)；CO2細胞培養箱(3110型，美國Forma Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 皮質神經元培養 具體方法參考文獻[5]，簡要步驟如下：取孕齡為15～16 d的C57BL/6小鼠，無菌條件下取出胎鼠，分離出全腦，去除腦組織中的腦干、小腦、橋腦及腦膜，分離出皮質，再用胰蛋白酶進行適時消化后，以含20%胎牛血清的解剖液終止消化，分離出小鼠皮質神經元，進行計數、接種培養，體外培養3～5 d后，分離出來的皮質神經元穩定生長，以此進行后續實驗。

1.2.2 分組 (1)空白對照組：未給予任何干預處理。(2)Aβ1-42單獨作用組(模型組)：僅給予5.0 μmol/L的寡聚態Aβ1-42作用于體外培養的皮質神經元。(3)人參皂苷Rg1處理組：體外培養的小鼠皮質神經元，給予不同濃度的人參皂苷Rg1預先孵育24 h，然后加入5.0 μmol/L的寡聚態Aβ1-42共同孵育48 h。(4)SB203580(p38抑制劑)處理組：予20 μmol/L的SB203580以及5.0 μmol/L寡聚態Aβ1-42共同孵育。(5)人參皂苷Rg1單獨作用組：僅給予10.0 μmol/L的人參皂苷Rg1作用于體外培養的皮質神經元。

1.2.3 神經元的免疫細胞化學鑒定 把神經元特異的磷酸化神經絲抗體作為神經元的特異性識別標志，采用免疫細胞化學技術(ABC法)檢測培養的皮質神經元的神經絲。主要步驟如下：培養成熟的神經細胞經3.7%甲醛固定30 min，加入過氧化氫甲醇溶液滅活內源性的過氧化氫物酶，予PBS洗滌后，通過動物血清封閉非特異性抗原，經PBS洗滌后，加入磷酸化神經絲抗體(MAB1592)孵育，經PBS洗滌后，加入鏈親和素-過氧化物酶溶液孵育，經PBS洗滌后，予新鮮配制的DAB溶液顯色、封片、顯微鏡下拍照。

1.2.4 Western-blot檢測 皮質神經元經處理后，用預冷的磷酸鹽緩沖溶液清洗殘余的細胞培養液，加入適量的細胞裂解液，神經元在冰上裂解 20 min，用細胞刮刀收集細胞后進行離心(14 000×g，4 ℃，10 min)，取上清液，用Bradford法對蛋白濃度進行定量，并以10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，轉膜，在室溫下使用封閉液進行封閉，一抗[p38/MAPK、p-p38/MAPK(Thr180/182)，1∶1 000稀釋]，4 ℃下孵育，洗滌，辣根過氧化物酶耦聯的抗鼠IgG二抗(1∶1 000稀釋)作用2 h，采用化學發光法顯色、曝光。以5、15、30和60 min為寡聚態Aβ1-42作用于皮質神經元細胞的觀察時間點，采用Western-blot方法檢測細胞內p38在Thr180和Thr182位點的磷酸化水平，以p-p38/p38的比值表示p38活性的變化，以β-actin為內參照，實驗重復3次。

1.2.5 TUNEL染色 參考文獻[6]，采用原位末端標記法檢測培養神經元的凋亡情況。簡要步驟如下：經干預處理后的神經元經多聚甲醛等進行固定，先后用NeuroPore試劑、淬鏈溶液(quenching solution)、末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)標記緩沖液進行處理，再用標記反應混合物進行作用，使用1×TdT停止緩沖液停止反應；接著使用Streptavidin-HRP處理、DAB顯色、細胞核復染、氨水返藍、中性樹脂封片處理。最后對染色區域內5個視野下的TUNEL陽性細胞進行計數。

1.2.6 caspase-3活性測定 參考文獻[6]，并根據說明書檢測caspase-3活性。簡要步驟如下：用人參皂苷Rg1或寡聚態Aβ1-42按不同的時間處理原代皮質神經元。將神經元刮下、離心、棄上清，按照50 μL溶液含2×105個細胞的比例裂解細胞、分離上清液，加入2×反應緩沖液/二硫蘇糖醇(DTT)混合物孵育1 h后，用熒光酶標儀(激發波波長380 nm/發射波波長460 nm)檢測熒光強度以評估caspase-3的活性。

2 結 果

2.1 神經元純度 體外培養5 d的神經元中絕大多數為磷酸化的神經絲抗體染色陽性細胞，胞體多呈橢圓形，有≥2個的突起；胞質和突起內神經絲呈棕黃色，胞核不著色(圖1)。

圖1 神經元純度鑒定(免疫化學染色 ×400)Fig.1 Identification of neuron purity (immunochemical staining ×400)

2.2 寡聚態Aβ1-42作用不同時間對皮質神經元p-p38和p38蛋白水平的影響 與空白對照組比較，在寡聚態Aβ1-42作用于原代皮質神經元5和15 min時，p-p38蛋白水平及p-p38/p38比值均明顯升高，差別均有統計學意義(P<0.05)，且在作用5 min時最為明顯(P<0.005)。但皮質神經元內p-p38/p38的比值隨著時間延長在組間呈下降趨勢(圖2)。

p-p38：磷酸化p38。1：空白對照組；2～5分別為5、15、30和60 min Aβ1-42單獨作用組。A：Western-blot條帶；B：Western-blot定量分析圖。與空白對照組比較，☆：P<0.05；☆☆☆：P<0.005。圖2 寡聚態Aβ1-42不同作用時間點對皮質神經元細胞p-p38、p38及p-p38/p38水平的影響Fig.2 Protein level of p-p38, p38 and p-p38/p38 in cortical neurons treated with oligomeric Aβ1-42 at different time points

2.3 人參皂苷Rg1減輕寡聚態Aβ1-42誘導的皮質神經元p38磷酸化 與模型組比較，不同濃度(2.5、5.0和10.0 μmol/L)的人參皂苷Rg1處理組可不同程度降低p-p38/p38的比值水平，差別均有統計學意義(P<0.001)，其中10.0 μmol/L處理組皮質神經元細胞中p-p38/p38水平低于2.5 μmol/L(P<0.005)及5.0 μmol/L處理組(P<0.01)。同時，SB203580處理組及10.0 μmol/L人參皂苷Rg1單獨作用組的p-p38/p38的比值低于Aβ1-42單獨作用組(P<0.001)。10.0 μmol/L人參皂苷Rg1單獨作用組p-p38/p38水平也低于空白對照組(P<0.001，圖3)。

p-p38：磷酸化p38；1：空白對照組；2：Aβ1-42單獨作用組；3：SB203580處理組；4～6：2.5、5.0和10.0 μmol/L人參皂苷Rg1處理組；7：10.0 μmol/L人參皂苷Rg1單獨作用組。A：Western-blot條帶；B：Western-blot定量分析圖。組間比較，☆☆☆☆：P<0.001；☆☆☆：P<0.005；☆☆：P<0.01。 圖3 不同濃度的人參皂苷Rg1對寡聚態Aβ1-42誘導皮質神經元細胞p-p38及p38水平的影響Fig.3 Effects of ginsenoside Rg1 at different concentrations on p-p38 and p38 in cortical neurons induced by oligomeric Aβ1-42

2.4 人參皂苷Rg1減輕寡聚態Aβ1-42誘導的皮質神經元凋亡 空白對照組的皮質神經元細胞及神經元間突觸形態及結構正常、完整，呈均勻分布，突觸間聯系光滑、完整、流暢(圖4A)。Aβ1-42單獨作用組皮質神經元明顯減少，神經元突觸形態屈曲、粗糙，結構不完整(圖4B)。10.0 μmol/L人參皂苷Rg1處理組皮質神經元細胞數目和突觸完整性、流暢性較Aβ1-42單獨作用組明顯改善(圖4C)。TUNEL染色結果顯示，與空白對照組皮質神經元細胞比較，Aβ1-42單獨作用組TUNEL陽性細胞/總細胞的比值明顯增高(P<0.001)；與Aβ1-42單獨作用組皮質神經元細胞比較，10.0 μmol/L人參皂苷Rg1處理組TUNEL陽性細胞/總細胞的比值明顯降低(P<0.001，圖5A)。皮質神經元的caspase-3的活性檢測結果顯示，在相同條件下，Aβ1-42單獨作用組皮質神經元的caspase-3活性較空白對照組顯著增加(P<0.001)；與Aβ1-42單獨作用組比較，10.0 μmol/L 人參皂苷Rg1處理組皮質神經元的caspase-3活性顯著降低(P<0.001，圖5B)。

A：空白對照組；B：Aβ1-42單獨作用組；C：10.0 μmol/L人參皂苷Rg1處理組。圖4 10.0 μmol/L人參皂苷Rg1對寡聚態Aβ1-42誘導的皮質神經元凋亡具有神經保護作用(倒置顯微鏡)Fig.4 10.0 μmol/L ginsenoside Rg1 has neuroprotective effect on apoptosis of cortical neuronsinduced by oligomeric Aβ1-42 (observed by inverted microscope)

1：空白對照組；2：Aβ1-42單獨作用組；3：10.0 μmol/L人參皂苷Rg1處理組。A：TUNEL染色陽性細胞與總細胞的比值；B：caspase-3活性檢測，指每毫克蛋白質中含量。組間比較，☆☆☆☆：P<0.001。圖5 10.0 μmol/L人參皂苷Rg1減少Aβ1-42誘導的皮質神經元凋亡Fig.5 10.0 μmol/L ginsenoside Rg1 has neuroprotective effect on apoptosis of cortical neurons induced by oligomeric Aβ1-42

3 討 論

AD是中老年人中最為常見的癡呆類型，但其病因至今尚不明確，其治療方法也有待進一步研發。在AD的病理學進展中，Aβ的瀑布學說仍為大多數學者所接受。該學說認為，Aβ可通過氧化應激、線粒體功能障礙等途徑引起神經元損傷和死亡、突觸缺失、神經炎癥和tau蛋白過度磷酸化，是觸發AD病理改變的一個中心環節。這些病理過程同時也促進了Aβ沉積[7-8]，從而進一步加速AD的病理損害和疾病的發展。在Aβ的毒性片段中，寡聚態Aβ1-42是細胞毒性最強的物質，也是研究AD病理生理的重要物質。本研究及課題組的前期研究[6，9]都通過神經元形態觀察、TUNEL染色技術和caspase-3活性檢測驗證了寡聚態Aβ1-42毒性對神經元的損害作用。因此，本研究選擇寡聚態Aβ1-42作為模擬AD病理生化的物質，并在前期以5.0 μmol/L Aβ1-42寡聚體誘導原代皮質神經元細胞損傷，成功制備了體外AD模型。

MAPK家族受廣泛的細胞外刺激影響，參與細胞增殖、分化和凋亡等一系列生理病理過程，其中c-Jun氨基末端激酶/應激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)與p38 MAPK均是MAPK家族的主要成員[10]。本課題組前期研究發現，具有神經毒性的寡聚態Aβ1-42(5 μmol/L)可誘導皮質神經元內的JNK磷酸化，活化的JNK/SAPK可參與介導線粒體損傷[3，6]，與文獻[11]的報道一致。而另一重要通路p38 MAPK激活后，可通過調控下游多種酶及轉錄因子的表達活性，從而對細胞功能進行調節。在AD模型中，p38 MAPK可同時作為氧化應激的下游因子被磷酸化激活，改變caspase-9的構象，并啟動caspase級聯反應，激活下游的caspase-3，通過蛋白水解作用，誘發過度的氧化應激，促進神經元的凋亡，加快AD的發病進程，其磷酸化程度與AD發病時間正相關[12]。同時，有研究認為，在與學習記憶相關的腦區中，高表達的p38 MAPK是海馬中代謝性谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor，mGluR)和N-甲基-D-天冬氨酸受體依賴性長時程抑制(long-term depression，LTD)形成的信號轉導途徑，參與了突觸可塑性調節[13-15]。在AD模型中，Aβ增多可通過p38 MAPK依賴性方式誘導mGluR-LTD，造成樹突棘損失，與記憶減退密切相關[16]。因此，p38 MAPK在AD的病理學進展中具有重要作用。本研究對不同作用時間(5、15、30、60 min)下Aβ1-42誘導皮質神經元p38蛋白磷酸化的情況進行探索，發現5.0 μmol/L寡聚態Aβ1-42作用5和15 min后，p38 MAPK在Thr180和Thr182位點的磷酸化水平明顯增高，且p38磷酸化水平在作用5 min后升高最為明顯，提示Aβ1-42介導的p38蛋白磷酸化是AD的早期病理生理過程中的關鍵環節，p38可能是研究AD治療的重要靶點之一。

人參皂苷Rg1在抗炎、抗氧化、延緩衰老等方面具有重要作用[17]。因此，本研究在AD的細胞模型中，以人參皂苷Rg1為干預手段，通過p38 MAPK探討其在AD早期氧化應激中的保護作用，觀察人參皂苷Rg1對寡聚態Aβ1-42誘導的神經元細胞p-p38和p38蛋白水平的影響，結果發現，人參皂苷Rg1可下調p38磷酸化水平。相對于未經Aβ1-42干預的空白對照組及10.0 μmol/L人參皂苷Rg1處理組，10.0 μmol/L人參皂苷Rg1單獨作用組的p-p38/p38水平明顯減低。一方面說明空白對照組(體外培養的皮質神經元)中也可能存在一定的應激反應和p38 MAPK信號通路，這與既往文獻[18-19]的相關研究結果一致，當然其具體機制仍需進一步研究，筆者也將在未來的研究中關注這一變化，探索其中的機制。另一方面論證了寡聚態Aβ1-42可增加p38磷酸化水平，組間差別也進一步說明了人參皂苷Rg1對p38 MAPK信號通路具有抑制作用。本研究發現，p38磷酸化水平隨人參皂苷Rg1濃度的增加而降低，其中10.0 μmol/L處理組中的p-p38水平及p-p38/p38比值最低，推測人參皂苷Rg1可能通過劑量依賴性方式抑制p38 MAPK，減少Aβ1-42誘導的神經元毒性。本研究還從形態學和凋亡兩方面探索了人參皂苷Rg1對皮質神經元的影響，結果發現，與模型組比較，10.0 μmol/L人參皂苷Rg1可有效保護神經元、維護突觸結構，檢測caspase-3的活性也得到相同的結果，進一步論證了人參皂苷Rg1在AD早期的應激反應中對神經元起保護作用。

本研究也存在一定局限性，雖然p38的異常磷酸化是AD早期病理生理過程中的重要環節，但AD的發病機制復雜，僅通過抑制p38活性并不能完全實現AD的治療目標。此外，本課題組進行的系列研究也發現，人參皂苷Rg1可能具有多靶點作用，后期將繼續探討人參皂苷Rg1的作用機制。

綜上所述，本研究發現寡聚態Aβ1-42可誘導p38磷酸化，激活p38活性；而人參皂苷Rg1可減輕p38磷酸化，具有保護神經細胞作用。因此，p38 MAPK信號通路可能參與人參皂苷Rg1保護神經元，減輕寡聚肽Aβ1-42誘導的神經元損傷。