TNF-α誘導大鼠軟骨細胞焦亡模型的建立與評價

徐 靚，吳玉嬌，袁曉陽，張 峰，程 剛，張運芳，魏 偉，嚴尚學

骨關節炎(osteoarthritis, OA)是一種以關節軟骨退變和關節腔炎癥為主要病理變化的慢性關節退變疾病[1]。軟骨細胞作為軟骨組織中唯一的細胞類型，其功能的改變在OA中發揮著不可替代的關鍵作用[2]。細胞焦亡又稱細胞炎性壞死，是一種由gasdermin蛋白介導的細胞程序性壞死[3]，表現為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致細胞內容物釋放進而激活強烈的炎癥反應。最近研究認為，細胞焦亡與OA病理進展密切相關，如焦亡在滑膜變化中起關鍵作用[4]，與OA疼痛的病理機制相關[5]，并且會加劇軟骨的退化[6]。已有關于細胞焦亡方面的研究多集中于OA滑膜細胞、巨噬細胞，軟骨細胞的相關研究較少。

基于細胞焦亡在OA發生發展過程中的作用，探索建立軟骨細胞焦亡的細胞模型，對進一步闡明OA的病理機制，評價和篩選OA治療藥物具有重要意義。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是參與OA的重要促炎性細胞因子，可驅動炎癥級聯反應、誘導大量炎癥和分解代謝因子產生[7]。該研究擬采用兩步酶消化法收集大鼠軟骨細胞進行體外培養，以不同質量濃度TNF-α誘導，模擬OA微環境，篩選出穩定的軟骨細胞焦亡體外模型，為進一步闡明OA發生機制、篩選治療OA的藥物并評價其療效及作用機制提供支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性SPF級SD大鼠，體質量約120 g，安徽省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(皖)2017-001。本實驗已通過安徽醫科大學臨床藥理研究所動物實驗倫理審查委員會批準(編號：PZ-2020-044)。

1.2 主要試劑Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司；大鼠IL-1β、IL-18酶聯免疫試劑盒購自上海酶聯公司；TNF-α購自美國Peprotech公司；抗磷酸化核轉錄因子-κB p65 (Phospho-NF-κB p65, P-p65)抗體及抗p65抗體為美國CST公司產品；抗半胱天冬酶1(caspase-1)抗體及抗gasdermin D(GSDMD)抗體為美國Proteintech公司產品；抗核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3 (nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptor containing protein 3, NLRP3)抗體及抗β-actin抗體為美國Affinity公司產品；抗基質金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13, MMP-13)抗體及抗Ⅱ型膠原(type Ⅱ collagen, Col Ⅱ)抗體為美國Novus公司產品。

1.3 主要儀器全波長多功能酶標儀(型號: Infinite M1000 Pro，瑞士Tecan公司)；熒光及化學發光成像系統(型號: ImageQuant LAS 4000，美國GE公司)；激光共聚焦顯微鏡(型號：TCS SP8)、倒置LED顯微鏡(型號：DMil)(德國徠卡公司)；場發射掃描電子顯微鏡(型號：GeminiSEM 300，德國蔡司公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1軟骨細胞的分離、培養 使用手術刀片緩慢刮取大鼠膝關節軟骨，無菌眼科剪將關節軟骨剪碎至體積為1 mm×1 mm×1 mm大小，加入0.25%胰蛋白酶置于37 ℃搖箱消化40 min，用含血清的培養基終止胰酶消化后，加入0.2%Ⅱ型膠原酶于37 ℃搖箱內繼續消化2 h，結束后將消化液吹散混勻，離心后PBS重懸，再離心，加入完全培養基分散細胞后轉移到普通培養瓶中培養，48 h后首次換液。待細胞長滿后進行傳代處理，三代以內原代軟骨細胞用于后續實驗。

1.4.2軟骨細胞鑒定 以甲苯胺藍染色與Col Ⅱ免疫組織化學染色進行軟骨細胞鑒定。采用爬片技術，細胞貼壁后取出蓋玻片，4 %多聚甲醛固定20 min，3 %過氧化氫室溫下孵育10 min，5% BSA封閉10 min，滴加Col Ⅱ一抗，4 ℃過夜。復溫后滴加生物素標記的二抗，室溫下孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。倒置相差顯微鏡下觀察并拍照記錄。對于甲苯胺藍染色，固定后用甲苯胺藍染色5 min，梯度乙醇脫水后常溫干燥，中性樹膠封片。

1.4.3CCK-8法檢測軟骨細胞的活力 制備細胞懸液，96孔板每孔加入5 000個細胞，過夜，細胞充分貼壁，給予TNF-α(0、5、10、20、40 ng/ml)不同濃度刺激，其中TNF-α(0 ng/ml)為對照組。48 h后每孔加入10 μl CCK-8，避光孵育1.5 h，酶標儀測定450 nm 處吸光度A值。細胞活力(%)=[ (A刺激組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%。

1.4.4Western blot檢測軟骨細胞焦亡信號蛋白、MMP-13及Col Ⅱ的表達 收集TNF-α(0、5、10、20、40 ng/ml)不同濃度刺激后的細胞，提取細胞總蛋白，電泳，轉膜，封閉，分別加入P-p65、p65、NLRP3、caspase-1、GSDMD、MMP-13、Col Ⅱ、β-actin等一抗孵育過夜，加二抗37 ℃孵育2 h，洗膜顯影。ImageJ軟件分析灰度值并進行統計分析。

1.4.5ELISA檢測軟骨細胞培養上清液中IL-1β、IL-18的水平 收集TNF-α(20 ng/ml )刺激組和對照組的細胞培養上清液，ELISA法測定IL-1β、IL-18的濃度。

1.4.6免疫熒光檢測軟骨細胞GSDMD表達 將軟骨細胞以TNF-α(20 ng/ml)處理48 h后，采用爬片技術以4%多聚甲醛固定20 min，用5%BSA封閉1 h，加入抗GSDMD抗體4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育1.5 h，以DAPI染核10 min，用抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.4.7掃描電鏡觀測軟骨細胞的形態學改變 將軟骨細胞以TNF-α(20 ng/ml)處理48 h后，采用爬片技術以2.5%戊二醛固定，乙醇梯度脫水、臨界點干燥、鍍膜、掃描電鏡觀察細胞形態。

2 結果

2.1 軟骨細胞形態學觀察經過兩步酶消化法分離得到的原代軟骨細胞為球形，呈懸浮狀態，大小均一，具有較強的折光性。貼壁后的軟骨細胞大部分呈圓形、橢圓形或短梭形，培養4 d后，軟骨細胞呈不規則的卵圓形或多角形，可見成簇現象。細胞基本爬滿瓶底后，此時軟骨細胞多為圓形，胞體豐滿，胞質均勻，核大而圓并且互相連接成“鋪路石”樣結構。傳代后細胞貼壁時間較原代細胞縮短，增殖速度加快(圖1)。

2.2 軟骨細胞鑒定3代內的陽性軟骨細胞甲苯胺藍染色可見細胞內有藍紫色異染顆粒，Col Ⅱ免疫組織化學染色可見胞漿呈棕黃色。分離培養后二者均為陽性的軟骨細胞比例約為98%。見圖2。

圖2 大鼠軟骨細胞鑒定 ×100A：甲苯胺藍染色；B：Col Ⅱ染色

2.3 不同濃度TNF-α對細胞活力的影響以不同濃度TNF-α處理軟骨細胞48 h，CCK-8檢測結果顯示(圖3)，隨著TNF-α濃度增加，軟骨細胞活力逐漸下降。與對照組比較，TNF-α(20、40 ng/ml)可抑制軟骨細胞活力(F=4.474，P<0.05)。

圖3 不同濃度TNF-α對細胞活力的影響(n=3)與對照組比較：*P<0.05

2.4 不同濃度TNF-α對軟骨細胞焦亡信號蛋白的影響圖4結果顯示，TNF-α(5、10、20、40 ng/ml)均可促進軟骨細胞P-p65、NLRP3、caspase-1、GSDMD的蛋白表達，且隨著濃度增加，蛋白表達水平逐漸升高。TNF-α(5 ng/ml)組P-p65、NLRP3、caspase-1、GSDMD的蛋白表達與對照組比較差異均無統計學意義。TNF-α(10 ng/ml)組P-p65、NLRP3的蛋白表達與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。而TNF-α(20 ng/ml)和TNF-α(40 ng/ml)處理的焦亡信號蛋白表達均存在顯著性差異(P<0.05或0.01)。結合CCK-8結果，選擇TNF-α濃度為20 ng/ml進行后續實驗。

圖4 TNF-α對軟骨細胞焦亡信號蛋白的影響(n=3)A：GSDMD/β-actin；B：caspase-1/β-actin；C：NLRP3/β-actin；D：P-p65/p65；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.5 TNF-α對軟骨細胞MMP-13和Col Ⅱ表達的影響為進一步了解TNF-α對軟骨細胞膠原代謝的影響，實驗檢測了TNF-α(20 ng/ml)刺激軟骨細胞后MMP-13和Col Ⅱ的表達水平。圖5結果顯示，TNF-α(20 ng/ml)可提高軟骨細胞MMP-13水平(t=4.337，P<0.05) ，降低Col Ⅱ的表達(t=4.287，P<0.05 )。結果提示TNF-α(20 ng/ml)破壞了軟骨細胞內的基質平衡。

圖5 TNF-α對軟骨細胞MMP-13和Col Ⅱ表達的影響(n=3)A：MMP-13/β-actin；B：Col Ⅱ/β-actin；與對照組比較：*P<0.05

2.6 TNF-α對軟骨細胞培養上清液中IL-1β、IL-18水平的影響ELISA結果顯示，與對照組細胞培養上清液中的IL-1β、IL-18水平相比，TNF-α(20 ng/ml)刺激可上調關節軟骨細胞培養上清液中促炎細胞因子IL-1β[(10.210±0.512)vs(24.680±0.449)，t=21.230，P<0.001]和IL-18水平[(40.000±3.408)vs(96.360±5.598)，t=8.599，P<0.01]。結果提示TNF-α(20 ng/ml)可促進軟骨細胞內炎癥因子IL-1β、IL-18的釋放。

2.7 TNF-α對軟骨細胞GSDMD表達的影響GSDMD定位于細胞質中，炎癥環境下細胞膜上亦有表達。與對照組軟骨細胞相比，TNF-α(20 ng/ml)刺激后的關節軟骨細胞GSDMD熒光表達增強。見圖6。

圖6 TNF-α刺激對軟骨細胞GSDMD表達的影響 ×630

2.8 TNF-α對軟骨細胞焦亡形態學的影響掃描電鏡結果(圖7)顯示，對照組軟骨細胞結構完整，TNF-α(20 ng/ml)刺激后關節軟骨細胞腫脹變形，細胞膜穿孔并破裂，顯微結構破壞。結果提示TNF-α(20 ng/ml)可誘導軟骨細胞發生焦亡形態學變化。

圖7 掃描電鏡下軟骨細胞的形態變化 ×1 000A：對照組；B：TNF-α組

3 討論

在經典的焦亡信號中，危險信號可刺激細胞膜上的模式識別受體并與之結合，形成由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白和效應分子caspase-1組成的NLRP3炎癥小體[8]，這些炎癥小體激活caspase-1后進一步切割GSDMD產生膜孔，導致細胞腫脹并最終溶解，釋放大量的促炎細胞因子，如IL-1β、IL-18等，這些致炎性細胞因子又進一步促進了焦亡的發生[9]。近年來研究[6]表明，OA患者的NLRP1和NLRP3表達水平顯著升高；在OA患者的軟骨中，未及時被吞噬的凋亡小體，可連同軟骨鈣化的增加通過繼發性細胞焦亡加重OA[10]，這些研究提示細胞焦亡與OA的發生、發展過程密切相關。

在本研究中，采用兩步酶消化法提取的大鼠軟骨細胞，細胞形態特征明顯，甲苯胺藍和Col Ⅱ染色為陽性，且純度達到98%以上，提示軟骨細胞提取分離成功。TNF-α(20 ng/ml)可抑制大鼠軟骨細胞活力，致細胞穿孔破裂、顯微結構破壞，其焦亡特征性信號分子P-p65、NLRP3、caspase-1和GSDMD表達水平上升，且培養上清液中IL-1β、IL-18水平升高。這些結果表明，TNF-α(20 ng/ml)可以成功誘導大鼠軟骨細胞焦亡模型。細胞外基質丟失被認為是OA軟骨損傷的主要原因之一[11-12]。在基質組成中，Col Ⅱ與其它膠原蛋白及非膠原蛋白結合，形成穩定的網狀結構，為軟骨提供拉伸強度[13]。在炎癥過程中，NF-κB途徑的激活抑制了軟骨細胞合成代謝，并誘導基質金屬蛋白酶的表達[2]。TNF-α(20 ng/ml)通過激活NF-κB信號促進大鼠軟骨細胞MMP-13表達升高，誘導Col Ⅱ降解，導致了軟骨細胞基質破壞。

綜上所述，TNF-α(20 ng/ml)可模擬炎癥微環境誘導大鼠軟骨細胞焦亡發生。該模型可廣泛用于研究OA發病機制及體外篩選治療OA的潛在藥物。