1型糖尿病食蟹猴左心室心肌組織超微結構變化

滕夏虹，陳 帥，鄒春林，杜可晨，曹津津，宋 瓊

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種獨立的、特異的心肌疾病，也是糖尿病致死的主要原因之一。青少年糖尿病患者發生心血管并發癥如急性心肌梗死的平均年齡在14.6歲[1]。有研究[2]表明，1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)青少年患者更容易出現嚴重的心肌損傷，并且男性心肌順應性低于女性。目前關于T1DM引起心肌組織超微結構改變的研究較少。由于非人靈長類動物在解剖結構、遺傳、生理和病理等方面與人類近似，能較好地模擬人類疾病發生發展的過程。該研究擬通過建立T1DM食蟹猴模型，初步探索長期高血糖條件下心肌組織超微結構的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及分組 選用6只3歲雄性食蟹猴(廣西瑋美生物科技有限責任公司提供[編號：SCXK桂2007-0002])，并飼養于廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司的靈長類實驗室[編號：SYXK桂2004-0003],隨機分為2組：①模型組(T1DM組)：通過靜脈注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導構建T1DM食蟹猴模型，其編號分別是M1、M2、M3；②對照組：正常食蟹猴, 其編號分別是C1、C2、C3。在實驗操作中按3R原則給予實驗動物人道主義關懷，嚴格按照國際實驗動物評估和認可管理委員會規定和要求對實驗動物進行日常的飼養和管理，實驗中所有涉及動物的實驗方案均得到了廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司實驗動物關懷與使用倫理委員會的批準(編號：W00013)。

1.1.2儀器與試劑 樂康全2型血糖儀和優越血糖試紙購自羅氏診斷產品上海有限公司；胰島素筆式數顯注射筆(諾和筆)購自諾和諾德(天津)生物技術有限公司；精蛋白生物合成人胰島素注射液(諾和靈50R胰島素筆芯)購自諾和諾德(中國)制藥有限公司；H-7650型透射電子顯微鏡購自日本日立公司；UC7型超薄切片機購自德國徠卡公司。STZ購自Sigma-Aldrich上海貿易有限公司；檸檬酸和檸檬酸鈉購自北京益利精細化學品有限公司；0.9%氯化鈉注射液購自購自安徽豐原藥業股份有限公司；硫酸阿托品注射液購自上海禾豐制藥有限公司；鹽酸氯胺酮注射液購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1T1DM食蟹猴模型的誘導 模型組3只雄性食蟹猴禁食12～15 h后，予以10 mg/kg氯胺酮和0.04 mg/kg阿托品麻醉后，靜脈注射STZ 68 mg/kg (用0.1 mmol/L、pH 4.5檸檬酸緩沖液和0.9%氯化鈉注射液配成5 mg/ml濃度)；對照組靜脈注射等體積的溶劑混合液。靜脈注射STZ后第1周每天監測空腹和非空腹血糖，自第2周開始每周2次監測空腹和非空腹血糖，當模型組動物血糖升高至11.1 mmol/L以上，需使用皮下注射胰島素維持代謝穩定及長期存活。

1.2.2T1DM食蟹猴模型皮下注射胰島素的原則 T1DM模型組動物在每天早上喂食前測量空腹血糖。當血糖小于11.1 mmol/L范圍內時，無需進行胰島素皮下注射；當血糖在11.1～16.6 mmol/L范圍內時，需要皮下注射1～2 U胰島素；當血糖在16.6～22.2 mmol/L范圍內時，需要皮下注射2～4 U胰島素；當血糖大于22.2 mmol/L，需要皮下注射4～6 U胰島素。注射胰島素后隨時觀察動物活動行為和監測血糖，防止因胰島素過量而導致低血糖性休克，并控制血糖在11.1 mmol/L以上。

1.3 組織制備和檢測指標

1.3.1電鏡標本制備和觀察 T1DM食蟹猴模型造模成功4年后，對T1DM模型組和對照組實驗動物進行安樂死，迅速取材，取左心室前壁心肌組織并切成體積大約為1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，用3%戊二醛4 ℃固定過夜，1%鋨酸室溫固定1 h，逐級乙醇-丙酮脫水，用Epon 812環氧樹脂包埋、聚合，利用徠卡UC7超薄切片機切成70 nm超薄切片，經2%醋酸雙氧鈾染色和6%檸檬酸鉛染色雙重染色后，于日立H-7650透射電子顯微鏡(電壓80 kV，放大倍率在5 000～70 000倍之間)觀察，在透射電子顯微鏡下，觀測左心室心肌組織超微結構，選擇反差效果好、無污染及損壞的部位，隨機選取視野進行拍照采集圖片。

1.3.2左心室心肌細胞線粒體和心肌微血管內皮細胞體視學分析 采用Image-Pro Plus 6.0軟件(美國Media Cybernetics公司)，測定左心室心肌細胞線粒體數目、周長和面積，測定左心室心肌微血管內皮細胞中吞飲小泡的數目、內皮細胞基膜厚度。根據Delesse原理，二維圖像上兩種結構截面的比等于它們在空間結構的體積比，從而計算出線粒體的體積密度、表面積密度、表面積體積比、相對數量和相對電子密度。體積密度：反映細胞質內線粒體在單位體積細胞質的相對體積；表面積密度：反映單位體積細胞質中的線粒體膜表面積；表面積體積比：線粒體表面積與線粒體體積的比值，反映線粒體形態。相對數量:單位體積細胞質中線粒體或單位內皮細胞胞質內吞飲小泡的數量。相對電子密度：單位線粒體面積內相對電子密度。

2 結果

2.1 構建T1DM食蟹猴模型T1DM模型組編號M1～M3食蟹猴空腹血糖變化如圖1所示，注射STZ后10 d開始T1DM模型組食蟹猴的空腹血糖大于11.1 mmol/L,提示T1DM 食蟹猴模型構建成功。

圖1 T1DM食蟹猴模型組空腹血糖A：注射STZ前；B:注射STZ后10 d；C:注射STZ后1年；D:注射STZ后2年；E:注射STZ后3年；F:注射STZ后4年

2.2 對照組左心室心肌細胞的超微結構心肌細胞排列整齊，胞質充滿大量平行排列的肌原纖維，I帶、A帶、H帶與Z線、M線均形成明暗相間的肌節結構(圖2A、B)；相鄰細胞間閏盤呈階梯狀，結構完整、清晰、連續(圖2C)；胞質較豐富，內含各種細胞器，內質網結構正常，可見豐富的線粒體和糖原，可見少量脂滴；心肌細胞內線粒體豐富，體積較大為橢圓形或長桿狀，呈線性網狀排列在肌原纖維之間，線粒體核膜完整，線粒體嵴結構清晰，基質密度及結構正常，線粒體周圍有糖原分布(圖2A、D)；心肌細胞核和核仁顯示良好，細胞核內物質分布較均勻，未見核裂解及固縮現象(圖2E)；心肌細胞肌原纖維橫斷面、粗細肌絲呈六角點陣排列(圖2F)。微血管內皮細胞呈扁平狀，細胞核完整，細胞器較少。

圖2 正常對照組食蟹猴左心室心肌超微結構A：胞質內肌原纖維 ×15 000；箭頭所示為平行排列的肌原纖維；B：明暗相間的肌節結構 ×30 000；C：閏盤連續，結構完整 ×30 000；D：線粒體豐富，線粒體嵴結構清晰 ×15 000；E：心肌細胞核及核仁顯示良好 ×5 000；星形所示為心肌細胞細胞核；F：粗細肌絲呈六角點陣排列 ×70 000

2.3 T1DM模型組左心室心肌細胞的超微結構心肌細胞肌絲束斷裂凝聚，肌原纖維排列紊亂，局部溶解斷裂、分離，Z線、M線模糊斷續，肌節結構模糊，肌漿網擴張(圖3A、B)；閏盤不連續、扭曲、模糊，閏盤處細胞連接不完整，閏盤間隙增寬，中間連接增寬，閏盤處的肌原纖維溶解斷裂(圖3C)；胞質內含細胞器較少，內質網、高爾基體腫脹變形，脂滴數量增多(圖3E、I)；肌原纖維排列紊亂，呈短片狀，胞質疏松、水腫、T管擴張，細胞間質膠原纖維增多(圖3F、G)；肌原纖維間線粒體分布不均勻，可見局部堆積大量大小不等、形態各異的線粒體，線粒體嵴變形、扭曲，局部線粒體基質溶解消失，形成空泡區，細胞膜下線粒體部分呈髓鞘樣變(圖3A、B、D、E)；心肌細胞核核膜皺縮變形，細胞核邊位，染色體固縮，呈多塊聚邊，核膜表面凹凸不平(圖3G)；心肌細胞橫斷面粗、細肌絲比例及分布異常(圖3H)。

圖3 1型糖尿病模型組食蟹猴左心室心肌超微結構A：肌原纖維局部溶解斷裂 ×15 000；箭：斷裂的肌原纖維；B：Z線、M線模糊斷續，局部線粒體溶解消失 ×30 000；箭頭：溶解的線粒體；C：閏盤斷裂、間隙增寬，閏盤處肌原纖維溶解斷裂 ×30 000；箭：閏盤斷裂處；箭頭：斷裂的肌原纖維；D: 線粒體部分呈髓鞘樣變 ×30 000；星：髓鞘樣變的線粒體；E：脂滴數量增多 ×15 000；星：脂滴；F：肌原纖維局部溶解斷裂，T管擴張 ×30 000；箭：斷裂的肌原纖維；箭頭：擴張的T管；G：心肌細胞核核膜皺縮變形，肌原纖維排列紊亂，膠原纖維增多 ×30 000；星：細胞核；箭頭：肌原纖維；箭：膠原纖維；H: 粗、細肌絲比例及分布異常 ×70 000；I：內質網腫脹變形 ×40 000；星：內質網

2.4 T1DM模型組與對照組左心室心肌細胞線粒體體視學比較通過觀察心肌細胞線粒體超微結構并進行體視學定量分析，結果顯示，與對照組相比，T1DM模型組左心室心肌細胞細胞質內線粒體數量減少(t=3.76，P<0.01)，見圖4A；單位線粒體面積內相對電子密度下降(t=5.61，P<0.000 1)，見圖4B；線粒體體積密度下降(t=4.53，P<0.001)，見圖4C；線粒體表面積密度下降(t=2.24，P<0.05)，見圖4D；線粒體表面積體積比、線粒體平均面積差異無統計學意義(圖4E、F)。

圖4 食蟹猴左心室心肌細胞線粒體體視學觀察A：細胞質內線粒體數量；B：單位線粒體面積內相對電子密度；C：線粒體體積密度；D：線粒體表面積密度；E: 線粒體表面積體積比；F：線粒體平均面積；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1

2.5 T1DM模型組與對照組左心室心肌微血管內皮細胞超微結構體視學比較為了解心肌微循環狀態對心肌細胞的氧、營養和代謝產物的交換及能量和信息傳輸等方面影響，通過觀察心肌微血管內皮細胞的超微結構并進行定量分析，與對照組相比，T1DM模型組單位內皮細胞胞質內吞飲小泡數量減少(t=11.47，P<0.000 1)，見圖5B、C；基底膜厚度增加(t=23.06，P<0.000 1)，見圖5D。

圖5 食蟹猴左心室心肌微血管內皮細胞體視學觀察A: 對照組心肌微血管內皮細胞 ×30 000；箭所示為吞飲小泡；箭頭所示為基底膜；B: 模型組心肌微血管內皮細胞 ×30 000；箭所示為吞飲小泡；箭頭所示為基底膜；C:模型組單位內皮細胞胞質內吞飲小泡數量減少；D:模型組內皮細胞基底膜厚度增加；與對照組比較：****P<0.000 1

3 討論

糖尿病是由多種因素所引起持續性血糖偏高，從而導致糖、脂肪、蛋白質代謝紊亂，進而導致多系統、多器官損傷，尤其是對神經系統、心臟、腎臟、視網膜及血管的影響[3-5]。糖尿病所致心肌病變的發病機理尚不明確，目前研究[6]表明其病理機制包括氧化應激、炎癥反應、線粒體結構功能改變、細胞凋亡與自噬、腎素-血管緊張素-醛固酮系統的異常激活等。目前有關T1DM患者的心肌組織超微結構的變化，以及T1DM動物模型所致心肌組織超微結構變化的研究較少。Sugawara et al[7]報道1例心功能不全的T1DM患者心肌細胞胞質中有大量脂滴。Dallak et al[8]研究顯示，STZ誘導建立的T1DM大鼠模型，其左心室心肌細胞的超微結構發生變化：核染色質異常，肌原纖維斷裂扭曲，肌絲廣泛分離，脂滴顯著增多；線粒體腫脹、線粒體嵴減少，部分呈空泡狀，閏盤斷裂錯位，肌節變短，并且肌節、線粒體損傷的比例升高。但由于大鼠等嚙齒類動物的遺傳學、病理學和生理學與人類相差較遠，從這些動物模型得出的結論并不完全適用于人類疾病，非人靈長類動物與人類親緣關系更加接近,其作為動物模型以研究人類疾病的結果更加準確。本研究對T1DM食蟹猴模型的研究結果顯示左心室心肌細胞中存在大量脂滴，課題組前期研究[9]表明T1DM食蟹猴脂代謝異常，提示脂代謝異?？赡苁且鹦募〖毎麚p傷的原因之一。此外，本研究通過對左心室心肌細胞線粒體體視學結構進行定量分析，結果顯示線粒體數量減少，線粒體相對電子密度、體積密度、表面積密度下降，更為具體地反映線粒體損傷情況。線粒體為脂肪酸和葡萄糖代謝的核心細胞器，通過氧化呼吸鏈實現氫的電子傳遞，經氧化磷酸化生成ATP[10]，線粒體結構和功能受損導致心肌細胞ATP供給不足，影響心臟舒縮功能[11]。

目前關于糖尿病引起的心肌微血管內皮細胞損傷的研究較少。Radosinska et al[12]研究表明，在自發型2型糖尿病大鼠模型中，心肌微血管內皮細胞吞飲小泡減少；Schneider et al[13]研究表明，在自發型糖尿病大鼠模型中，心肌微血管內皮細胞的基底膜增厚；并且上述兩項研究均未做定量分析。本研究通過對左心室心肌微血管內皮細胞的超微結構體視學定量分析，首次報道誘導型T1DM食蟹猴模型左心室心肌微血管內皮細胞損傷特征為吞飲小泡數量減少和基底膜增厚。其可能原因：一方面，脂代謝異常導致極低密度脂蛋白在體內大量蓄積，引起腫瘤壞死因子α表達升高，促進氧化應激反應，導致糖基化終末產物在微血管內膜、心肌細胞胞質沉積，引起微血管內皮細胞損傷和心肌纖維化[14]；另一方面，高血糖促進血管內皮細胞氧化應激反應，經糖異生途徑，導致糖基化終末產物積累，通過激活蛋白激酶C，進而引起內皮細胞損傷[3]。