鮟鱇魚、魷魚、馬面魚明膠提取工藝優化

區兌鵬，張小軍，嚴忠雍，鄭 斌

(1 浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江 舟山，316022；2 浙江省海洋水產研究所，浙江 舟山，316022)

鮟鱇魚一般生活在海平面以下200～500 m的海底深處，屬硬骨魚類，胺鳙目、鮫鳙科，為近海底層肉食性魚類，中國沿海均有產[1]。魷魚，也稱柔魚、槍烏賊，是軟體動物門頭足綱鞘亞綱十腕總目管魷目開眼亞目的動物，常成群游弋于深約20 m的海洋中[2]。馬面魚俗名橡皮魚、剝皮魚，中國東海、黃海均有分布，屬于外海近底層魚類[3]。在魚類加工帶來的廢料當中，魚皮占到了總量的40%～55%[4]。這3種海洋魚類在銷售及食用過程中，均會進行去皮處理，去除的魚皮變成了加工廢棄物，因此，需要進行二次加工處理，使其變廢為寶[5]。王錫念等[6]通過超聲波輔助酶解提取鮟鱅魚皮膠原蛋白，膠原蛋白提取率(3.25±0.68)%。馬華威等[7]對鮟鱇魚皮進行了酶溶性膠原蛋白對自由基的清除作用實驗，顯示該膠原蛋白具有體內外清除自由基作用。李琳等[8]利用酶工程技術，以魷魚為主要的利用對象，通過選擇適宜的蛋白酶和控制酶解過程，研究開發水產膠原蛋白及其家聚肽制品，但明膠提取還是少數。宋正規等[9]以馬面魚皮為原料，優化胃蛋白酶提取馬面魚皮膠原蛋白工藝，并對所提膠原蛋白進行結構分析。

魚皮明膠是魚皮經過適度水解及熱變性后所得到的功能性生物聚合物，其氨基酸含量極高，目前在諸多食品領域均有分布[10]。從牛羊等畜類提取的明膠會攜帶傳染性海綿狀腦病毒、豬瘟病毒；禽類提取的明膠會攜帶甲型流感等病毒[11]。而從魚皮中提取明膠能夠提供一個可接受的、替代原來禽畜來源的產品[12]。與禽畜類明膠相比，魚皮明膠的膠凝和熔化溫度更低，同時在熔化過程中還展現出了高聚物特征[13]。明膠的產量和品質不僅受原料組織提取工藝的制約，而且還取決于pH、預處理、提取溫度和提取時間[14]。目前普遍采用酸法、堿法、酸鹽法及鹽堿法來處理明膠。其原理為借助酸、堿、酶處理，使得膠原纖維分子間與分子內的共價交聯及非共價鍵受到破壞，使得膠原分子被釋放，再借助加熱，斷裂膠原螺旋氫鍵，最終釋放明膠[15]。熱水提膠時，水分子融入膠原分子鏈間隙，保證膠原分子三鏈螺旋架構的次級鍵氫鍵斷裂，而加熱能夠提升這一過程的效率，讓膠原成為明膠[16]。酸法提取能最大限度地保持其三股螺旋結構，但產品得率較低[17]；堿法迅速且徹底，但含羥基和巰基的氨基酸全部被破壞且產生消旋作用(結構變異)[18]。

本研究以酶處理后，再經過熱水法提取，對鮟鱇魚、魷魚、馬面魚3種魚皮進行明膠提取優化試驗，沒有采取一貫前處理和提取工藝分開優化，而是連接了前處理及提取階段合并優化，以降低處理時間并提高明膠得率，為明膠后續特性研究建立良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

魷魚皮(中國水產舟山海洋漁業有限公司)、鮟鱇魚皮(中國水產舟山海洋漁業有限公司)、馬面魚皮(舟山國際水產交易市場)；NaOH、木瓜蛋白酶(50 000 U/g)、胰蛋白酶(3 800 U/mg)、中性蛋白酶(50 000 U/g)、胃蛋白酶(30 000 U/g)。

1.2 儀器與設備

DF-101S恒溫磁力攪拌器(邦西儀器科技(上海)有限公司)、HH-S11.6數顯恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)、Avanti JXN-30離心機(美國Beckman Coulter公司)、SCIENTZ-10N冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 方法

1.3.1 魚皮明膠制備

將購買的魚皮用水進行清洗，除去血水及雜質，稱取一定量魚皮在燒杯內，以1∶4(W∶V)加入0.05%的NaOH溶液，并使用磁力攪拌器攪拌1 h，使魚皮除去油脂的同時能夠充分膨脹。轉入50 mL離心管5 000 r/min離心5 min，離心半徑為10 cm，棄去上清液，下層魚皮使用蒸餾水漂洗至中性，加入酶，在適宜的溫度下進行酶解。當魚皮被完全酶解后進行8 000 r/min離心5 min，離心半徑為14 cm，取上清液在適宜的提膠溫度下進行明膠提取、濃縮，取濃縮液15 mL進行冷凍干燥。

1.3.2 單因素試驗設計

酶種類中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶；酶添加量，底物量的0.4%～0.8%；酶解時間1～3 h；酶解溫度，30 ℃、35℃、40℃；提膠時間1～3 h；提膠溫度(60℃、65℃、70℃、75℃)。設置基本條件為中性蛋白酶、酶添加量0.6%、酶解時間2 h、酶解溫度35℃、提膠時間2 h、提膠溫度70℃。以明膠得率為指標，進行3次平行試驗。

1.3.3 響應面試驗設計

以單因素試驗為前提，以明膠得率為響應值，測定羥脯氨酸含量。對影響明膠得率的前處理條件及提膠條件作5因素3水平響應面優化分析，結果均以Design-Expert 8.0軟件分析。獲取提取最佳工藝參數。因素水平的具體參數見表1。

表1 響應面實驗設計因素與水平

1.3.4 明膠得率計算

(1)

式中：X1明膠得率，%；W1—魚皮明膠干粉質量，g；W2—魚皮濕質量，g。

1.3.5 明膠羥脯氨酸含量基酸

采用羥脯氨酸試劑盒，對3種魚皮明膠的羥脯氨酸含量進行試驗。①取1 g明膠樣品到試管中并加入1 mL蒸餾水，準確加入水解液1 mL加蓋后95℃沸水浴水解20 min。②流水冷卻后加入指示劑10 mL，搖勻。③各管準確加入調節pH甲液1 mL，混勻(此時溶液應為紅色)。④在渦旋儀上逐滴加入pH調節乙液，直至液體中指示劑顏色為黃綠色。⑤加入蒸餾水10 mL，混勻。⑥取3～4 mL加適量活性炭，混勻，3 500 r/min離心10 min，用注射器吸取1 mL于波長550 nm，1 cm光徑，蒸餾水調零，測定各管吸光值。計算公式如下：

(2)

式中：X2羥脯氨酸含量，μg/mg干重；A0空白OD值；A1標準OD值；A2測定OD值；B標準品含量(默認5)，μg/mL；C水解液總體積，mL；D組織干質量，mg。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶的種類對明膠得率的影響

酶種類對明膠得率的影響如圖1所示。

圖1 酶的種類對明膠得率的影響

酶的特異性使其與底物作用的位點存在差異性，酶解得到膠原肽的數量和明膠被水解的程度不同[19]。由圖1可知，對3種魚皮使用3種蛋白酶酶解，中性蛋白酶的明膠得率均遠高于其他兩種蛋白酶，相較于其他2種酶經過木瓜蛋白酶處理所得明膠最低。這與李劍瑛等[20]所做的赤魟魚魚皮膠原肽提取結果相似，均為中性蛋白酶>胰蛋白酶>木瓜蛋白酶。

2.1.2 酶的添加量對明膠得率的影響

酶添加量對明膠得率的影響如圖2所示。

圖2 酶的添加量對明膠得率的影響

針對相異魚皮，酶添加量過多，會使得膠原水解程度過大，大分子亞基產生次級降解，無法取得較高的明膠得率[21]；其次隨著酶添加量的增多，反應速率加快，當酶的添加量到一定質量濃度時，反應開始下降，說明酶與底物反應充分，此時反應速率與酶添加量無關，產物質量濃度的增大對提取率會有一定的抑制作用[22]。由圖2可知，鮟鱇魚在酶添加量為0.7%時明膠得率最高，為12.491%，在魷魚中，添加量從0.4%到0.8%明膠得相對平穩，維持在6%之間，但相比之下，當酶添加量在0.5%時明膠得率最高，為6.856%。馬面魚在酶添加量為0.6%時，明膠產率最高，為5.317%。

2.1.2 酶解時間及溫度對明膠得率的影響

酶解時間及溫度對明膠得率的影響如圖3所示。

圖3 酶解時間及溫度對明膠得率的影響

由圖3可知，隨著溫度及時間的增加，鮟鱇魚和魷魚的明膠得率在40℃/2h時最高，分別為15.108%、11.555%。而馬面魚在30℃/1h時明膠的率最高，為6.413%。對于鮟鱇魚和魷魚而言，可能是因為隨著溫度的上升，酶的活性逐漸升高，酶解效率逐漸增高，當達到一定程度后，隨著溫度的升高蛋白酶變性導致酶活下降，酶解效率從而逐漸下降[23]。而馬面魚酶處理最佳因素在30℃/1h，說明馬面魚酶處理最優條件在30℃/1h附近，也說明了對不同的底物，最優酶解溫度是有區別的，只有達到這一最優溫度，才能避免酶解不充分及過度的情況；處理時間過低 原料中非螺旋結晶區、非共價交聯鍵并未得到很好的破壞，無法取得較高的明膠得率[24]；如果處理時間太長，也會使得膠原水解程度過大，同樣難以獲取較高的明膠得率[25]。

2.1.3 提膠時間及溫度對明膠得率的影響

圖4所示，在溫度低時，氫鍵、分子間靜電等作用力被破壞，隨之導致一些膠原螺旋結構解體，明膠中某些大分子組成，例如亞基結構，溶出量減少[26]。隨著溫度升高，能夠讓已被破壞的膠原化學鍵數量提升，膠原解體速度、程度均加快，更多的亞基組分被釋放，從而明膠凝膠強度增加[27]。然而需要注意的是，假設溫度太高，大分子物質會被降解為次級產物，膠凝膠強度會呈下降趨勢[28]。處于75℃/1h時，鮟鱇魚和魷魚明膠得率最高，分別為13.921%、9.612%。而馬面魚提膠條件在65℃/2h時，明膠得率最高，為5.152%。

圖4 提膠時間及溫度對明膠得率的影響

2.1.4 單因素條件確定

對于3種不同魚類的魚皮，魷魚水分含量高、馬面魚水分含量少，而鮟鱇魚水分含量介于兩者之間，經NaOH處理后，使魚皮去腥除雜的同時，和膠原蛋白分子堿性基團融合[29]；斷裂分子內或分子間離子鍵、氫鍵，釋放出明膠原分子，并且讓魚皮體積更大，松散度提升，為之后的提膠提供便利[30]。在經NaOH處理過程中，鮟鱇魚、魷魚得到充分膨脹，而馬面魚由于本身含水量較低，膨脹現象并沒有其他兩種魚皮明顯，這導致經酶解提膠處理后，馬面魚明膠得率非常低，從整體上看明膠得率鮟鱇魚>魷魚>馬面魚。由于中性蛋白酶對3種魚皮處理的明膠產率遠高于其他兩種酶，因此在響應面優化中選擇中性蛋白酶進行后續試驗。表2為3種魚皮單因素最優條件，于該前提下作響應面優化試驗設計。

表2 單因素最優條件

2.2 響應面法優化3種魚皮明膠提取工藝

2.2.1 響應面模型建立及回歸方差分析

綜合分析單因素試驗結果后，選擇中性蛋白酶，酶添加量為0.5%、0.6%、0.7%。鮟鱇魚和魷魚的選取條件一致：酶解溫度選擇38、40、42℃，酶解時間1.5、2、2.5 h，提膠溫度選取73、75、77℃，提膠時間0.5、1、1.5 h。馬面魚酶解溫度選取28、30、32℃，酶解時間0.5、1、1.5 h，提膠溫度選取63、65、67℃，提膠時間0.5、1、1.5 h。以明膠得率為響應值，結果見表3。其中A為酶添加量、B為酶解時間、C為酶解溫度、D為提膠時間、E為提膠溫度、X1為明膠得率、X2為羥脯氨酸含量。

利用Design-Expert 8.0軟件對上述試驗結果進行二次回歸擬合，得到3種魚皮明膠得率的二次回歸方程。

3種魚F值分別為12.8104、20.4914、25.782 0，P均小于0.000 1，表明該模型極其顯著，二次模型失擬項分別為F=2.365 8、P=0.426 5；F=1.276 3、P=0.426 5；F=0.812 5、P=0.668 4均不顯著，說明3種魚皮明膠得率模型可接受，可用于評估變量參數對明膠得率的影響。多元關系分別為R2=0.911 1、R2=0.942 5、R2=0.953 8，說明該模型可用于3種魚皮明膠工藝參數的預測與優化。

在回歸模型的5個影響因素中，提膠溫度對3種魚皮明膠提取率的影響最大(鮟鱇魚：0.890 3、魷魚：54.071 5、馬面魚：22.239 3)。鮟鱇魚皮明膠二次項A2、B2、C2、D2、E2，魷魚皮明膠二次項A2、B2、D2、E2，馬面魚皮明膠二次項A2、C2、E2均達到及其顯著水平(P<0.01)；魷魚皮及馬面魚皮明膠一次項E呈極其顯著水平(P<0.01)，即提膠溫度對魷魚皮及馬面魚皮明膠提取有顯著影響；證明不同要素對3種魚皮明膠得率影響，并非單純的線性關系。

表3 響應面試驗設計與結果

2.2.2 響應面各因素交互作用分析

為了更好、更直觀地了解各因素交互情況下對各指標的影響情況，根據回歸模型方差分析所得數據得出相應的響應面交互圖，并研究了酶添加量、酶解溫度及時間、提膠溫度及時間對3種魚皮明膠提取率的交互影響。響應面圖可以體現兩要素間相互作用關系[31]，3D圖里，曲面傾斜度與坡地陡度和兩要素間交互作用呈正向關聯；另外，借助等高線圖，能夠相當顯著地看出要素間交互顯著度，假設其為圓形，則代表缺乏明顯交互作用，假設為橢圓形，則代表擁有明顯交互作用。

由圖5～8的3D圖和等高線平面圖可看出，與溫度有關的3D圖更陡，橢圓形呈現較好，等高線更密集。說明無論前處理還是提膠過程，提取溫度對3種魚皮明膠提取的影響是最大的，這與二次回歸模型方程結果一致。

圖5 酶添加量和提膠溫度分別對3種魚皮明膠得率交互影響的響應面與等高線圖

圖6 酶解時間和提膠溫度分別對3種魚皮明膠得率交互影響的響應面與等高線圖

圖7 酶解溫度和提膠溫度分別對3種魚皮明膠得率交互影響的響應面與等高線圖

圖8 提膠時間和提膠溫度分別對3種魚皮明膠得率交互影響的響應面與等高線圖

基于上面對3種魚皮明膠響應面交互分析后可知，在明膠得率影響要素方面，溫度的影響最大。因為借助酶預處理，使得穩定膠原纖維分子間與分子內的共價交聯及非共價鍵遭破壞，最大限度地釋放原膠原分子[32]。在溫度影響下，使得明膠間的交聯鍵被削弱，從而使膠原變成了溶于水的明膠[33]。

由于明膠提取涉及前處理與提膠2個步驟，由3種魚皮明膠提取響應面交互分析可知，前處理(酶解處理)步驟或提膠步驟內所呈現的等高線圖，橢圓形呈現更好。而前處理步驟與其后的提膠過程有些因素交互并不是很好，例如酶添加量與提膠時間、酶解溫度與提膠時間，等高線圖近乎呈現圓形，說明生產明膠的兩個步驟既相互獨立又有所關聯，但前處理步驟或提膠步驟內對明膠影響更大。酶解和提膠時間響應面交互圖里，坡度平緩，即酶解時間、提膠時間兩者交互對魚皮明膠提取影響不大，但在明膠提取的兩個步驟中扮演著不可或缺的因素。

羥脯氨酸是典型的明膠特征性的一種氨基酸[34]，其含量取決于明膠原料，相異種類明膠里，其含量并不一致。據表3得，當明膠產率高時，羥脯氨酸的含量也高，即羥脯氨酸含量與3種魚皮明膠產率近似成正比的關系。并且水產膠原蛋白的熱穩定性也與羥脯氨酸含量成正比[35]。有研究表明生活在低溫環境中的生物，膠原蛋白中脯氨酸的羥基化程度較低[36]。

2.2.3 驗證試驗

軟件模擬的最優方案見表4，鮟鱇魚皮、魷魚皮明膠提取最優工藝均為：酶添加量0.6%、酶解時間2 h，酶解溫度40℃、提膠時間1 h、提膠溫度75℃；馬面魚皮明膠提取最優工藝：酶添加量0.6%、酶解時間1 h，酶解溫度30℃、提膠時間2 h、提膠溫度65℃。

表4 Design-Expert 8.0軟件模擬最佳工藝及驗證試驗值

使用最優工藝進行3類魚皮明膠提取試驗，并重復3次。鮟鱇魚皮明膠得率24.598%；魷魚皮明膠得率20.807%；馬面魚皮明膠得率11.227%。由結果可看出3種魚皮明膠得率均優于軟件預測值，說明響應面優化3種魚皮明膠得率試驗具有實際參考意義。

3 結論

經過響應面分析發現，酶解溫度及提膠溫度對這3種海洋魚類魚皮明膠提取率影響最大，不同因素對3種魚皮明膠得率影響，并非單純的線性關系。且當明膠產率高時，羥脯氨酸的含量相應的較高，即羥脯氨酸含量與3種魚皮明膠產率近似成正比的關系。通過優化明膠提取工藝，鮟鱇魚明膠得率為24.598%，魷魚明膠得率為20.807%，馬面魚皮明膠提取率為11.227%。

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