基于網絡藥理學與數據挖掘分析中藥調節DNA甲基化的用藥規律

張艷 周慶兵 徐鳳芹

摘要 目的：探究調節DNA甲基化的中藥活性成分和用藥規律。方法：運用GeneCards數據庫獲取DNA甲基化相關基因靶點，通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）查找靶基因相關的活性成分和中藥，納入條件為類藥性≥0.18，口服生物利用度≥30%，構建中藥-成分-甲基化靶點作用網絡。采用DAVID 6.8數據庫分析潛在靶點參與的生物過程及信號通路，同時收集中藥功效及性味歸經信息，分析調節DNA甲基化的用藥規律。結果：獲得23個潛在的DNA甲基化靶點，與449個活性成分和342味中藥相匹配。其中山柰酚、槲皮素、木犀草素、黃芩素、異鼠李素等可能是干預DNA甲基化的主要活性成分，甘草、半枝蓮、丹參、枸杞子、燈盞細辛等可能是干預DNA甲基化的主要中藥。相關通路以TNF信號通路、Toll樣信號通路等抗炎通路為主。用藥規律分析顯示，干預DNA甲基化的中藥多性寒、味苦，歸肝經，具有清熱、止痛、補益等功效。結論：本研究系統探討了中藥調節DNA甲基化的活性成分，歸納了中藥干預DNA甲基化的用藥規律，以期為治療DNA甲基化相關疾病的實驗驗證及新藥研發提供思路。

關鍵詞 DNA甲基化;表觀遺傳學;數據挖掘;用藥規律;網絡藥理學;活性成分;中藥;信號通路

Medication Rules of Chinese Medicines in Regulating DNA Methylation Based on Network Pharmacology and Data Mining

ZHANG Yan1，2，ZHOU Qingbing1，3，XU Fengqin1，3

（1 Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China; 2 Graduate School，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 3 Institute of Geriatrics，Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China）

AbstractObjective： To explore the active components and medication rules of Chinese medicines in regulating DNA methylation. Methods： GeneCards was used to search for the gene targets related to DNA methylation，and Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） to search for the active ingredients and herbal medicines related to the target genes.The inclusion conditions were drug-likeness≥0.18 and oral bioavailability≥30%，and the herbal medicine-component-target network was constructed.DAVID 6.8 was used to analyze the biological processes and signaling pathways involving the potential targets.At the same time，the efficacy，property，taste，and meridian tropism of the Chinese herbal medicines were collected to analyze the medication rules for regulating DNA methylation. Results： Twenty-three potential targets of DNA methylation were obtained，which were matched with 449 active components and 342 Chinese herbal medicines.Quercetin，kaempferol，luteolin，baicalin，and isorhamnetin may be the main active components for interfering with DNA methylation.Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，Scutellariae Barbatae Herba，Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma，Lycii Fructus，and Erigerontis Herba may be the main Chinese herbal medicines for interfering with DNA methylation.The anti-inflammatory pathways such as TNF and Toll-like signaling pathway were mainly involved.The Chinese herbal medicines used for interfering with DNA methylation are cold and bitter，with tropism to the liver meridian and the main effects of clearing heat，relieving pain，and tonifying. Conclusion： This study predicted the active components of Chinese herbal medicines in regulating DNA methylation and summarized the medication rules for intervening with DNA methylation.It provides ideas for the experimental verification of treating DNA methylation-related diseases and the development of relevant drugs.13394B73-CB2C-4322-A0A1-5D8D25E41881

Keywords DNA methylation; Epigenetics; Data mining; Medication rule; Network pharmacology; The active ingredient; Traditional Chinese medicine（TCM）; Signaling pathways

中圖分類號：R272;R249;R285 文獻標識碼：A ?doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.010

DNA甲基化（DNA Methylation）屬于表觀遺傳學范疇，是指在DNA甲基轉移酶DNMT3a，DNMT3b和DNMT1催化下，選擇性地將甲基基團添加到CpG序列5-胞嘧啶，形成5-甲基胞嘧啶的化學修飾過程[1]。DNA甲基化可以調控下游基因表達，從而在生命活動中起著重要的作用，有學者認為調控DNA甲基化是干預疾病的新手段。盡管人體所有類型的細胞包含相同的DNA序列，但它們的甲基化模式是不同的。理解這個系統對理解如何建立穩定的細胞表型及其對正常生理、衰老和疾病的影響至關重要[2]。

目前調控DNA甲基化的西藥僅在血液腫瘤疾病領域進入臨床階段，其余病種尚處于臨床前階段[3-5]。近年來，中藥調控DNA甲基化的研究越來越多。據報道，中藥復方及單體可通過調控DNA甲基化治療血液、腫瘤、動脈粥樣硬化等疾病[6-15]。未來需要對中醫藥干預異常基因甲基化進一步研究。

由于中藥多成分、多靶點的特點，很難系統地尋找到干預DNA甲基化的中藥及其用藥規律。鑒于此，本研究從數據挖掘及網絡藥理學角度出發，構建DNA甲基化-靶點-活性成分-中藥關系網絡，挖掘用藥規律，以期為未來中藥調控DNA甲基化研究提供一定的思路及方向。

1資料與方法

1.1DNA甲基化靶點篩選及通路分析

通過GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org）收集DNA甲基化相關靶點，檢索詞為“DNA methylation”。GeneCards數據庫基本覆蓋幾大數據庫對于基因的分析數據，是人類基因的綜合數據庫。應用DAVID 6.8數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對最終納入研究的潛在靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路分析。

1.2活性成分篩選及靶點-活性成分網絡構建

根據DNA甲基化靶點信息，通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）納入與靶點相關且類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18、口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%的活性成分。

1.3DNA甲基化靶點-成分-中藥網絡構建

關聯活性成分相關中藥，構建DNA甲基化靶點-成分-中藥網絡，運用Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化分析。通過對網絡節點度值（Degree）分析，識別網絡中的關鍵節點，同時初步探討中藥和活性成分對DNA甲基化的干預強度。

1.4中藥數據整理與歸納

以《中華人民共和國藥典》2020版為標準，將中藥名稱規范，并對其性、味、歸經及療效進行統計分析。中藥功效信息整理方法如下：以藥典記錄的功效為準則，按詞頻分解，如“清熱解毒”分解為“清熱”“解毒”，“涼血止血”分解為“涼血”“止血”，若中藥功效不能分解，如“活血化瘀”“補益肝腎”等則整體分析，相似功效合并分析。

2結果

2.1DNA甲基化靶點篩選及通路分析

本研究共篩選到14 008個DNA甲基化靶點。將候選靶點置于TCMSP，以化合物OB≥30%、DL≥0.18為條件納入化合物匹配的靶點，共計23個。見表1。

核心靶點涉及基因表達正調控（Positive regulation of gene expression）、序列特異性DNA結合轉錄因子活性的調控（Regulation of sequence-specific DNA binding transcription factor activity）、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控（Positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter）等56項生物過程（Biological Process，BP）（ P <0.05）;酶結合位點（Enzyme binding）、MAP激酶活性（MAP kinase activity）、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性、配體激活序列特異性DNA結合（RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity，ligand-activated sequence-specific DNA binding）等20項分子功能（Molecular Function，MF）（ P <0.05）;核漿（Nucleoplasm）、細胞外隙（Extracellular space）等10項細胞組分（Cell Component，CC）（ P <0.05）;僅展示每種類別前10項。見圖1。 P <0.05的信號通路共有56條，主要包括：TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、FoxO信號通路、GnRH信號通路、MAPK信號通路和Toll樣受體信號通路等，前20條信號通路。見圖2。13394B73-CB2C-4322-A0A1-5D8D25E41881

2.2活性成分篩選及靶點-活性成分網絡構建

檢索到449個調控DNA甲基化的相關化合物。靶點-活性成分網絡由508個節點，11 440條邊構成。Degree值排名前5%的化合物有槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、木犀草素（Luteolin）、芒柄花黃素（Formononetin）等24個，上述活性成分與DNA甲基化相關靶點聯系較多為重要成分。Degree值前5位的靶點為AR、PPARG、PGR、TNF、ICAM1，這些靶點與眾多小分子物質相互作用，與DNA甲基化密切相關。見表2。

2.3DNA甲基化靶點-成分-中藥網絡構建

與DNA甲基化靶點相關的483種活性成分，追溯到相關中藥399味。除去《中華人民共和國藥典》未報道的中藥58味（例如白藥子、八角蓮、大風子等），共獲得中藥334味。甲基化靶點-成分-中藥網絡共808個節點，14 760條邊。DNA甲基化靶點與34味中藥關聯Degree值位于前10%，包括甘草182、半枝蓮46、枸杞子43、丹參42、燈盞細辛42、銀杏葉42、葫蘆巴41、苦參40、淫羊藿40、山豆根37、蔓荊子37、降香37、菊花37、紅花36、香附36、余甘子36、雞血藤35、白果35、香薷35、金銀花34、連翹34、延胡索34、黃芪34、沙苑子34、馬鞭草33、沙棘33、紫菀33、麻黃32、沒藥31、半邊蓮30、青蒿30、桑葉30、旋覆花30和夏枯草30。構建了34味中藥-成分-甲基化靶點網絡，包括300個節點，4 137條邊，其中紅色倒三角表示DNA甲基化，桃紅色菱形表示靶點，綠色六邊形表示中藥，粉色長方形表示活性成分，Degree值越大形狀越大。見圖3。

2.4中藥性味-歸經-功效結果統計

研究發現，寒性、苦味及歸屬肝經的藥物對DNA甲基化調節作用最強，分別占比36.97%、35.84%、24.63%。歸經前3位為肝經、肺經、脾經;性前3位依次為寒、溫、熱;味前3位為苦、辛、甘。就功效而言，共分解-歸納出中藥功效20種，其中具有清熱、解毒、補益功效位于前3位，占比分別為18.81%、10.96%、9.33%。Degree值位列前茅的藥物與性味、歸經及功效的用藥規律相符。見圖4。

3討論

DNA甲基化易受環境、飲食等因素影響，改變 基因表達而不改變DNA序列[16]。因此，許多研究者將中醫預防治療原則與表觀遺傳學相結合，通過改善環境、情緒，甚至通過中藥、針灸和飲食的干預，更好地預防疾病[17]。本研究發現槲皮素、山柰酚、木犀草素、芒柄花黃素、異鼠李素、薯蕷皂苷配基、鞣花酸、漢黃芩素、黃芩素、（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯、β-胡蘿卜素、花葵素、煙酸等與DNA甲基化靶點連接較多，被認為是干預DNA甲基化的主要活性成分。其中，兒茶素、槲皮素等多酚及天然黃酮類物質，具有抗炎、抗氧化作用，還可通過抑制DNMTs活性抑制甲基化[18]。（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯是最有效的人DNMT1抑制劑，通過沒食子酸的部分特異性抑制該酶的催化活性[18]，其抗氧化活性與恢復抗氧化酶活性有關[19]。槲皮素通過對基因表達的影響發揮抗氧化、抗炎作用。研究發現，槲皮素降低了DNMT1的總活性和NF-E2相關因子2（Nrf2）基因啟動子區DNA甲基化水平[20]。山柰酚誘導腫瘤細胞凋亡的同時對正常細胞起保護作用。山柰酚可能通過調控DNMTs和組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACs）蛋白表達，從而降低結直腸癌抑制因子DACT2基因表達水平，抑制Wnt信號通路阻斷腫瘤細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制轉移性腫瘤的遷移且抑制MMPs[21]。此外，山柰酚可通過核因子κB炎癥信號通路減輕炎癥反應，增強機體抗氧化能力。本研究未涉及的低頻化合物如白藜蘆醇也有調控DNA甲基化的作用[22]。高頻活性成分多“藥食同源”，保證了中藥開發的安全性，也體現了食療的可靠性[23]。核心通路MAPK方面，梔子、川芎顯示對MAPK信號通路差異甲基化基因的雙向調節作用[24]。

通過對靶點-成分-中藥網絡分析，發現甘草、半枝蓮、枸杞子、丹參、燈盞細辛、銀杏葉等中藥所含靶點數目較多，因此推測它們對DNA甲基化有更大影響。對中藥信息結果統計發現，肝、肺二經占影響DNA甲基化機制中藥的44.36%，性味以寒、溫，苦、辛、甘為主，苦寒之品多有清熱解毒的功效，甘溫之類多有扶正溫補之效，此亦與中藥功效分析結果相一致。根據上述結果推測治療DNA甲基化相關疾病應注重清熱活血解毒，扶正祛邪的作用。此外，中醫學認為寒屬陰，溫屬陽，陰陽的屬性與低甲基化、高甲基化特性不謀而合[25-26]。此外，DNA甲基化個性化的特點與中醫藥辨證論治個體化特點相符，更凸顯中醫藥調控DNA甲基化的研究前景。中醫藥陰陽理論、個性化、動態性的特點可以指導表觀遺傳學的發展。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學構建了DNA甲基化靶點-成分-中藥網絡，并系統闡述了三者間的關系。通過數據挖掘方法歸納與DNA甲基化相關的活性成分及中藥的相關信息，以期為DNA甲基化相關疾病的治療和新藥研發提供線索。本研究也存在一定局限性，僅從藥物-靶點-疾病相關性入手，并未考慮量-效關系，后期需要基礎實驗及臨床試驗的驗證[27]。此外，甲基化與中藥的機制研究需要遺傳學、社會學、心理學等多學科的支持和交叉。

所有作者間不存在利益沖突。

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（2021-04-07收稿本文編輯：楊覺雄）

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81973679）;國家重點研發計劃“中醫藥現代化研究”專項（2017YFC1700301）;中醫藥傳承與創新“百千萬”人才（岐黃工程）岐黃學者作者簡介：張艷（1991.09—），女，博士研究生在讀，研究方向：中醫藥防治心血管病，E-mail：zhangyan8120@163.com通信作者：徐鳳芹（1962.05—），女，博士，教授，主任醫師，研究方向：中醫藥防治心血管病，E-mail：Dr.xufengqin@outlook.com13394B73-CB2C-4322-A0A1-5D8D25E41881