微生物群落結構對泡菜質量的影響研究進展

徐清萍，法子柱，李雯

(1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，鄭州 450001；2.食品生產與安全河南省協同創新中心，鄭州 450001)

泡菜是以各類蔬菜為主要原料，經加工發酵形成的浸漬成品，在世界各地已有數千年歷史。泡菜種類很多，包括中式泡菜、西式泡菜、日式泡菜、韓式泡菜。

泡菜發酵是一個多菌種發酵的過程。從有益的方面看，蔬菜原料經過乳酸菌發酵會產生很多化合物，如有機酸(乳酸和醋酸)、二氧化碳、酒精、維生素、益生元和其他香味物質，這些產物使泡菜呈現出各種風味和感官特性。由于蔬菜原料及配料的選擇與處理、發酵工藝和衛生條件各有差異[1]，不同產地泡菜制作工藝中形成的菌群各異，繼而進一步影響著泡菜的風味及泡菜中各項指標。從不利的方面看，用于泡菜生產的蔬菜原料表面附著著大量的附生微生物，如霉菌、酵母、腸桿菌科細菌和假單胞菌，而泡菜發酵系統為有害微生物的生長提供了適宜的條件，如豐富的營養物質、適宜的含氧量和pH值。這些有害菌在泡菜中產生有害的代謝物和毒素，對最終產品的質量和消費者的健康造成嚴重危害。其次，亞硝酸鹽的積累是泡菜生產中常見的另一個問題。亞硝酸鹽促進致癌N-亞硝基化合物的內源性合成，特別是亞硝胺。因此，降低發酵過程中的亞硝酸鹽濃度也很重要。蔬菜發酵過程中腐敗菌和亞硝酸鹽積累是影響腌菜、泡菜產業和消費者健康的常見問題。

1 泡菜中的微生物菌群及影響因素

泡菜發酵是一個多菌種發酵的過程，PCR-DGGE、qPCR、高通量測序技術、SMRT測序技術等逐步被用于泡菜發酵過程中微生物群落結構的解析[2-4]。

各種研究表明泡菜發酵是一個多菌種發酵過程，不同原料、產地、工藝、發酵階段中的菌群結構也存在著差別。青菜泡菜[5]發酵過程中，絕對優勢真菌德巴利氏酵母(Debaryomyces)貫徹整個發酵中期，畢氏酵母(Pichia)在發酵第15天為絕對優勢菌，奧默柯達菌(Kodamaeaohmeri)在發酵第81天為絕對優勢菌，檢測到的主要優勢真菌有假絲酵母(Candida)等。四川泡菜[6]隨著發酵代數的增加，泡菜母水中的細菌與真菌多樣性呈下降趨勢，微生物群落構成趨于穩定；乳桿菌(Lactobacillus)是達到穩態的泡菜母水中的主要細菌屬，哈薩克斯坦酵母(Kazachstania)是達到穩態的泡菜母水中的主要真菌屬。四川工業泡菜[7]發酵過程中，變形菌門是泡菜發酵前期的優勢菌門，而發酵中期和后期的優勢菌門為厚壁菌門；在整個發酵過程中，乳桿菌屬的含量呈現出明顯的增加，假單胞菌屬的含量有所降低，鹽單胞菌屬和弧菌屬的含量均基本保持不變。關于泡菜和辣白菜的細菌多樣性研究結果表明[8]，辣白菜中乳酸桿菌、菌絲體和魏斯氏菌的相對豐度明顯高于泡菜，而寡養單胞菌和沙雷菌在泡菜中的比例則低于泡菜。

采樣地點和原輔料不同對發酵泡菜中真菌菌群結構均有一定的影響[9]。不同的貯藏時間對泡菜菌相構成[10]有影響，泡菜貯藏階段的乳酸菌以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)為主，但相對豐度因貯藏時間而存在差異；貯藏3年的泡菜以單孢釀酒酵母(Kazachstaniaexigua)和Kazachstaniabulderi為主，貯藏12年的泡菜以膜璞畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)為主。

大量研究表明，泡菜發酵過程中乳酸菌、酵母菌和腸桿菌數量動態變化，絕對的優勢菌——乳酸菌主導了泡菜發酵，分離的最多的菌(優勢菌)為該屬中植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)[11]。韓國泡菜中優勢乳酸菌屬主要為明串珠菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬，乳酸菌種的分布與演替主要受制作泡菜的原材料、發酵溫度和鹽濃度等因素影響[12]。鄧維琴等[13]對多代發酵泡菜中微生物多樣性的研究表明，乳酸菌是泡菜母水中的優勢細菌，酵母菌是優勢真菌。張其圣等[14]對低鹽泡菜發酵過程中的乳酸菌群落結構動態變化的研究表明，發酵前期的主要優勢菌群是乳酸乳球菌和食竇魏斯氏菌，發酵中、后期的主要優勢菌群是戊糖乳桿菌。羅強等[15]從中國北方4個不同地區的20份傳統自然發酵泡菜樣品中分離乳酸菌，結果表明各地區泡菜樣品的微生物菌群組成有差異，其中遼寧和河南的泡菜樣品中微生物種群最為豐富，吉林的泡菜樣品中產酸菌數量最多。從自然發酵的蔬菜和水果中分離出來的主要乳酸菌屬包括乳酸桿菌(Lactobacillus)、明串株菌(Leuconostoc)、魏斯氏菌(Weissella)、腸球菌(Enterococcus)和球菌(Pediococcus)等[16-17]。

2 泡菜中的微生物群落結構對泡菜質量的影響

泡菜的質量指標與泡菜中的菌群結構有著密切的相關性，有些微生物的存在會導致其質量的下降，而有些微生物的存在則起到改善調節作用。

2.1 泡菜的質構及風味

泡菜發酵過程中的微生物直接影響著泡菜的質構及風味。陳卓等[18]以分離于自然發酵泡菜中的植物乳桿菌和酵母菌作為功能菌強化發酵制作泡菜，結果表明自然發酵泡菜風味與人工接種功能菌發酵泡菜風味差異較大，不同發酵時間和接種量的泡菜風味物質的種類和含量也有所差異。代程洋等[19]對比15株發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentatum)和15株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)對發酵泡菜的質構特性及風味的影響，結果表明，發酵乳桿菌發酵泡菜的咀嚼性顯著高于植物乳桿菌(P<0.05)，且純種發酵泡菜的硬度、脆性及咀嚼性均高于自然發酵組；植物乳桿菌發酵的泡菜水酸味值和芳香型氣味值顯著高于發酵乳桿菌(P<0.05)，且略高于自然發酵組。

2.2 泡菜的品質

泡菜發酵過程中的微生物直接影響著其品質的好壞。工業化泡菜生產中經常會出現泡菜發臭、發黃、軟腐等品質敗壞現象，這些品質的改變直接與發酵過程中的微生物相關。泡菜發酵過程中芽孢桿菌和多種酵母菌如假絲酵母、釀酒酵母等常會導致泡菜表面長出一層白膜，即“生花”現象，從而導致品質敗壞并產生不愉快的酸臭味[20]。蔡炯等[21]以腐敗四川泡菜為研究對象，對其菌相構成和主要腐敗菌特性進行研究，菌株致腐特性結果顯示B.methylotrophicus、B.subtilis、B.licheniformis、P.peoriae和P.membranifaciens是腐敗泡菜中主要的腐敗微生物。易宇文等[22]從泡菜中分離純化生花菌株，通過分子生物學技術鑒定其為畢赤酵母菌。

2.3 生物胺含量

泡菜中的生物胺含量與菌群結構相關。由于微生物的代謝活動，發酵食品中可以產生生物胺，泡菜中的天然微生物菌群是影響發酵過程中形成的生物胺量的一個重要因素。植物乳桿菌是泡菜中最常見的鑒定組，由于受到菌群、輔料、儲藏條件等多種因素的影響，天然發酵泡菜中的植物乳桿菌菌株可產生不同范圍低濃度的生物胺，但多數不在毒性范圍內[23]。四川泡菜中主要的生物胺為腐胺、尸胺、組胺、酪胺，其中能產生生物胺的細菌包括解鳥氨酸拉烏爾菌(Raoultellaornithinolytica)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)、阿耶波多氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)，其中R.ornithinolytica含有賴氨酸脫羧酶cacd基因和組氨酸脫羧酶hdc基因，回接培養基驗證了其具有尸胺和組胺形成能力[24]。

2.4 亞硝酸鹽

亞硝酸鹽的積累是腌菜、泡菜發酵中常見的問題，尤其是未腌制完全的蔬菜。亞硝酸鹽是能引起癌癥和其他健康問題的N-亞硝基化合物的前體，降低亞硝酸鹽濃度對保證食品安全供應具有重要意義。即使是同一品種蔬菜，亞硝酸鹽含量也可能相差很大[25]。泡菜中的亞硝酸鹽含量與發酵過程中的菌群結構有關。泡菜發酵過程中有些微生物的存在會促進亞硝酸鹽含量的增加，而有些微生物則對其有降解作用。朱琳等[26]對蘿卜泡菜發酵液中亞硝酸鹽濃度峰值期和回落期時細菌群落結構多樣性進行研究，結果表明，伴隨著亞硝酸鹽濃度變化，蘿卜泡菜發酵過程中細菌群落結構多樣性也發生演替，與發酵液中亞硝酸鹽的形成和降解密切相關。其中，亞硝酸鹽峰值期發酵液樣品中以變形菌門細菌最為優勢，以Erwinia、Aeromonas、Pseudomonas、Shigella和Delftia(5.1%)為主要優勢菌屬；厚壁菌門為第二優勢菌門，Lactococcus為其中的主要優勢屬。回落期發酵液樣品中以厚壁菌門最為優勢，優勢屬包括Leuconostoc、Lactococcus、Weissella和Pediococcus等。曹佳璐[27]對重慶家庭制傳統泡菜的分析表明亞硝酸鹽含量僅與費爾斯莫爾德鎮乳桿菌(Lb.versmoldensis)存在顯著正相關，與Enterobacteriaceae細菌及其他優勢菌群無顯著相關性。

乳酸菌發酵能降低泡菜中的亞硝酸鹽含量。與自然發酵相比，接種腸膜明串珠菌[28]發酵四川泡菜，人工接種混合菌種(檸檬明串珠菌∶植物乳桿菌植物亞種∶短乳桿菌為2∶3∶1，濃度比)[29]發酵娃娃菜，采用短乳桿菌LactobacillusbrevisAR123單獨發酵或與商業發酵劑混合發酵泡菜[30]等方式均能降低亞硝酸鹽含量。采用食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)共接種發酵能降低四川泡菜中亞硝酸鹽和生物胺的濃度[31]。泡菜中的某些乳酸菌對亞硝酸鹽具有降解作用。宋昊芮等[32]從低鹽泡菜發酵中分離到的多株乳酸菌，對亞硝酸鹽分解能力最強的是干酪乳桿菌，其次是植物乳桿菌，分解能力最差的是食品乳桿菌。郭志華等[33]從泡菜中篩選出6株降解亞硝酸鹽的乳酸菌，其中4株鑒定為植物乳桿菌，2株鑒定為發酵乳桿菌，其中發酵乳桿菌JYF2和JYF3具有抑菌性，對革蘭氏陽性菌的抑制作用大于革蘭氏陰性菌。

2.5 雜菌污染

泡菜中的菌群結構與雜菌污染密切相關，泡菜發酵過程中存在著雜菌及致病菌污染風險。楊麗等[34]對檢索結果中13篇文獻的50批次四川泡菜發酵過程中大腸桿菌消長數據進行定量系統評價，結果表明，四川泡菜發酵過程中，大腸桿菌在數量上大體呈現為先升后降的動態變化模式，大腸桿菌數量的峰值與初始值之間有顯著的正向相關。閆鳴霄等[35]根據15篇涉及發酵泡菜中微生物高通量測序數據的文獻分析泡菜中食源性致病菌存在的風險，表明泡菜發酵操作方式和泡菜中食源性致病菌污染風險有明顯關聯：家庭泡菜易出現腸桿菌屬和假單胞菌屬致病菌，工業泡菜中李斯特菌屬致病菌出現機會較大；蘿卜、白菜泡菜中出現致病菌的機會相較其他原料泡菜更大；發酵時間與葡萄球菌屬和李斯特菌屬致病菌的出現表現出明顯的正相關；高鹽泡菜中金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌有可能生長；中、低鹽泡菜中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌都可能出現明顯生長，沙門氏菌尤其具有較大的生長優勢。抗菌性乳酸菌對致病菌具有抑菌性。泡菜中的一些乳酸菌具有抑菌性，如發酵乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌等[36]。

蔬菜發酵過程中腐敗菌和亞硝酸鹽積累是影響泡菜產業和消費者健康的常見問題。由于泡菜生產的蔬菜原料表面附著著大量的附生微生物，乳酸菌只占蔬菜原料原始微生物群系的一小部分。Xia等[37]研究表明增加自然發酵初期乳酸菌數和鹽濃度可以抑制有害菌，降低亞硝酸鹽的產量，但增加鹽濃度會抑制乳酸菌的生長，延長發酵周期，影響風味物質。因此，低鹽條件下控制有害細菌生長的發酵技術是提高泡菜質量的關鍵。Zheng等[38]利用噬菌體控制泡菜發酵過程中腐敗菌的生長及亞硝酸鹽的產生。

3 前景和展望

發酵過程中微生物群落的多樣性與鹽濃度、貯藏溫度有關，而泡菜的各項質量指標變化，包括感官、酸度、亞硝酸鹽、大腸菌群等各項理化及衛生指標都與發酵過程中的菌群種類及群落結構相關。

乳酸菌中有多種類型菌株可以對食源性致病菌，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有抑菌性，將其應用于泡菜發酵，在發酵過程中無明顯亞硝酸鹽高峰[39]。香辛料是泡菜發酵生產中常用的輔料，不同香辛料對乳酸菌生長及抑菌性的影響不同[40]。這表明通過調整泡菜發酵過程中的相關參數及使用抑菌性乳酸菌有利于實現對泡菜等食品發酵、運輸和貯藏過程中致病菌風險控制，防止雜菌污染，有效地延長食品保質期。獲得具有抑菌、改善發酵條件的能力及使用安全的乳酸菌對實現低鹽發酵及生產健康、高品質產品、發酵過程安全控制具有積極意義。