調味香料桂丁中黃酮類化合物的提取、純化及抗氧化活性研究

杜麗霞，姜子濤,2*，肖建軍，白甜甜

(1.天津天獅學院 食品工程學院，天津 301700；2.天津商業大學 生物技術與食品科學學院，天津 300134)

桂丁(Fructuscinnamomi)是一種常被用于辣味火鍋底料及鹵料中的調味香辛料，往往與其他香辛料配合使用，起到去腥、增香的作用。桂丁，別名桂丁香、肉桂子、桂子，為樟科植物肉桂樹10—11月份采摘未成熟的果實曬干而成，主要產地為中國福建、臺灣、海南、廣東、廣西、云南等地的熱帶及亞熱帶地區，其中尤以廣西栽培為多，大多為人工純林。桂丁具有溫里散寒、止痛、止呃之功效，常用于治療心胸疼痛、胃腹冷痛、惡心、噯氣、呃逆、嘔吐以及肺寒咳喘。目前，國內外對桂丁的研究主要集中在揮發油的分析[1-4]以及醇提物的抗氧化活性[5-6]方面，而對其他活性成分的研究較少，尤其是提取和純化桂丁黃酮類化合物的研究鮮有報道。因此，本研究以桂丁為原料，探究其中黃酮類化合物的提取條件、純化條件以及清除DPPH自由基的能力，為調味香料桂丁的進一步開發利用提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桂丁：廣西壯族自治區玉林市；DPPH：美國Sigma-Aldrich公司；蘆丁標準品：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇：廊坊市拓迪化工有限公司；5種類型大孔樹脂：天津南大樹脂科技有限公司，使用前按照文獻[7]進行預處理；所用試劑均為分析純，試驗用水均為去離子水。

CW-2000超聲-微波協同萃取/反應儀 上海新拓分析儀器科技有限公司；N-1100V-WD旋轉蒸發儀 日本東京理化器械株式會社；UV1000單光束紫外可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 桂丁黃酮提取工藝條件的優化方法

按照參考文獻[8]中的方法繪制蘆丁標準曲線，提取和測定桂丁中黃酮類物質的含量[9]。通過設計四因素五水平的單因素試驗，分別探究了提取時間(20，40，60，80，100 min)、提取溫度(40，50，60，70，80 ℃)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/mL)以及乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)對桂丁黃酮得率的影響，得到各因素下的優水平，然后通過L9(34)正交試驗進一步優化，得到桂丁黃酮的最佳提取工藝條件。

1.2.2 桂丁黃酮純化工藝條件的優化方法

用最佳提取工藝條件得到桂丁黃酮粗提液，經冷凍干燥后，用少量乙醇溶解，用水配制成濃度為1 mg/mL的工作液，用于后續純化條件的優化。通過靜態吸附和解吸試驗[10]從5種不同型號的大孔樹脂(HPD-100、HPD-600、AB-8、DM130、D101)中篩選出適合桂丁黃酮純化的大孔樹脂，采用靜態法優化了上樣液pH(2，4，6，8)及洗脫液乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%)，采用動態法[11]優化了上樣流速(1.0，1.5，2.0 BV/h)及洗脫流速(1.0，1.5，2.0 BV/h)，最終得到桂丁黃酮的最佳純化工藝方案。

1.2.3 評價桂丁黃酮抗氧化活性的方法

對參考文獻[12]中的方法略作修改，配制不同濃度梯度經最佳條件純化后的桂丁黃酮溶液，各取0.6 mL與6 mL 0.6 mmol/L DPPH溶液混勻后，在避光條件下反應30 min，在517 nm下測定吸光度值，計算各濃度桂丁黃酮的清除率，得到清除率曲線，最后計算IC50值，同法測定天然抗氧化劑維生素C(Vc)的IC50值，通過比較兩者大小，評價桂丁黃酮的抗氧化活性。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

按照1.2.1中的方法繪制蘆丁標準曲線，得到回歸方程為y=0.4374x+0.0038，R2=0.9993，桂丁黃酮提取液的濃度均用以上方程進行計算。

2.2 提取桂丁黃酮的單因素試驗結果

桂丁黃酮的單因素試驗結果見圖1。

圖1 單因素對桂丁黃酮得率的影響Fig.1 Effect of various factors on the extraction rate of Fructus cinnamomi flavonoids

由圖1中a可知，在一定時間內，提取時間越長，越有利于黃酮類物質的充分溶出，得率隨之提高，但當提取時間超過80 min時，桂丁黃酮得率反而下降，這是因為超聲波作用時間過長，導致不穩定的黃酮類化合物開始快速分解，而使得率下降，因此選擇80 min為最佳提取時間。由圖1中b可知，當提取溫度由40 ℃升高至70 ℃時，黃酮得率隨之快速提高，這是由于提高提取溫度，能加速分子運動，促進黃酮物質從細胞中溶出，但當提取溫度升至80 ℃時，過高的溫度會加速黃酮物質的氧化分解，得率降低，因此選擇70 ℃為最佳提取溫度。由圖1中c可知，料液比為1∶40(g/mL)時，桂丁黃酮得率達到最高，當料液比過小時，提取溶劑量過少，黃酮物質在溶劑中飽和后便不再溶出，而當料液比過高時，提取溶劑量過多，反而不利于超聲波的傳導，使黃酮得率降低，因此選擇1∶40(g/mL)為最佳料液比。由圖1中d可知，乙醇濃度為50%時，桂丁黃酮得率最高，當乙醇濃度過低時，醇溶性黃酮無法被充分溶出，而當乙醇濃度過高時，水溶性黃酮又無法被充分溶出，因此選擇50%為最佳乙醇濃度。

2.3 提取桂丁黃酮的正交試驗結果

表1 正交試驗結果Table 1 The results of orthogonal test

由表1正交試驗結果可知，對桂丁黃酮得率影響最大的提取因素是提取時間，然后是乙醇濃度和提取溫度，影響最小的是料液比。桂丁黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度50%、料液比1∶50(g/mL)、提取時間60 min、提取溫度60 ℃。在此條件下平行提取3次，得到的桂丁黃酮得率分別為10.50%、10.59%、10.56%，平均值為10.55%。

2.4 優化桂丁黃酮純化工藝條件的試驗結果

2.4.1 大孔樹脂的篩選結果

5種大孔樹脂的篩選結果見表2。

表2 大孔樹脂的篩選結果Table 2 The screening results of macroporous resins

由表2可知，型號為AB-8的大孔樹脂對桂丁黃酮的吸附和解吸效果均最佳，因此選擇大孔樹脂AB-8來分離純化桂丁中的黃酮類化合物。大孔樹脂法由于溶劑消耗量小、設備簡單、能再生利用、成本低廉而早已被廣泛地應用于植物類黃酮的分離純化中，其中AB-8型號大孔樹脂在許多種植物類黃酮中均表現出較好的純化效果[13-15]。

2.4.2 最佳上樣液pH值的確定

圖2 上樣液pH值對樹脂吸附桂丁黃酮效果的影響Fig.2 Effect of pH value of loading solution on adsorption of Fructus cinnamomi flavonoids by resins

由圖2可知，上樣液pH為4時，吸附后上清液中殘留的黃酮吸光度值最低，說明大孔樹脂在pH為4時對桂丁黃酮的吸附能力最強。當pH低于4時，桂丁黃酮以分子狀態存在，極性大大降低，而AB-8大孔樹脂為弱極性，具有一定親水性，因此吸附效果降低；而當pH高于4時，隨著pH的升高，桂丁黃酮的存在形式逐漸向鹽轉變，極性過大，樹脂的吸附效果逐漸降低。

2.4.3 最佳洗脫液乙醇濃度的確定

圖3 洗脫液乙醇濃度對桂丁黃酮洗脫效果的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration of eluent on the elution effect of Fructus cinnamomi flavonoids

洗脫液的乙醇濃度是影響洗脫效果的主要因素。由圖3可知，隨著洗脫液乙醇濃度的增大，從大孔樹脂解吸下來的桂丁黃酮吸光度值先增大后減小，當乙醇濃度為50%時吸光度值最高，說明此條件下解吸效果最好。洗脫液乙醇濃度過小時，極性過大，乙醇濃度過大時，極性又過小，均不能充分地將桂丁黃酮從大孔樹脂上洗脫下來。

2.4.4 最佳上樣流速的確定

圖4 上樣流速對桂丁黃酮吸附效果的影響Fig.4 Effect of loading flow rate on the adsorption effect ofFructus cinnamomi flavonoids

由圖4可知，當上樣流速為1.0 BV/h時，樣液流經大孔樹脂內部的速度過慢，接觸面積減小，降低黃酮吸附率，因此最先達到泄漏點。當上樣流速為2.0 BV/h時，由于流速過快，導致黃酮與大孔樹脂的作用時間較短而吸附不完全，泄漏點出現較快。當上樣流速為1.5 BV/h時，泄漏點出現的最晚，說明此流速下，黃酮能充分地吸附在樹脂上，上樣效果最佳。

2.4.5 最佳洗脫流速的確定

圖5 洗脫流速對桂丁黃酮洗脫效果的影響Fig.5 Effect of elution flow rate on the elution effect ofFructus cinnamomi flavonoids

由圖5可知，當洗脫流速為1.5 BV/h時，洗脫下來的桂丁黃酮所呈現的峰形較窄，峰值較高，洗脫效果最佳。當洗脫流速過快時，洗脫液與樹脂作用不充分，洗脫效果不佳。當洗脫流速過慢時，雖洗脫充分，但黃酮容易擴散，導致峰形較寬，峰高降低，純化效果不佳。

2.5 桂丁黃酮抗氧化活性的評價

圖6 桂丁黃酮及Vc的清除率曲線Fig.6 The curves of scavenging rates of Fructus cinnamomi flavonoids and Vc

由圖6可知不同濃度下桂丁黃酮及Vc對DPPH自由基的清除率結果。分別對其進行多變量擬合，得到桂丁黃酮及Vc的清除率曲線，并據此計算出桂丁黃酮和Vc的IC50值分別為82.11 μg/mL和45.55 μg/mL。可見桂丁黃酮在一定濃度具有較強的抗氧化作用，但其抗氧化活性比Vc差；與文獻[5]比對發現，其抗氧化活性高于生姜、中藥茴香籽、陳皮、砂仁和山奈等調味香料。

3 結論

采用超聲波輔助提取法提取調味香料桂丁中的黃酮類化合物，得到的最佳提取條件是：乙醇濃度50%、料液比1∶50(g/mL)、提取時間60 min、提取溫度60 ℃，桂丁黃酮的得率為10.55%。用大孔樹脂法分離純化桂丁中的黃酮類化合物，得到的最佳純化條件是：上樣流速1.5 BV/h、洗脫流速1.5 BV/h、上樣液pH值4、洗脫液乙醇濃度50%，在此條件下，其純度由30.1%提高至62.6%。同時，通過清除DPPH自由基試驗，以天然抗氧化劑Vc作參比，評價桂丁黃酮的抗氧化活性，結果顯示：桂丁黃酮的抗氧化活性雖然比Vc弱，但仍表現出一定的抗氧化作用，且活性比部分天然香辛料強。