降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選鑒定及發酵特性研究

胡蝶，趙鑫，張素平，祁勇剛,3，吳勇超，高冰,3，柳志杰,3*

(1.湖北工業大學 生物工程與食品學院 湖北省食品發酵工程技術研究中心，武漢 430068；2.湖北聚匯農業開發有限公司，湖北 荊門 431821；3.湖北省發酵蔬菜企校聯合創新中心，湖北 荊門 431821)

泡菜是中國傳統發酵食品之一，各地做法不一；大多是由圓白菜等大宗蔬菜經食鹽腌漬后發酵而成。冷加工方式保護了蔬菜中營養物質并使其具備貯藏性質，在一定程度上可以調節蔬菜因季節變化而帶來的供需關系和解決蔬菜浪費問題[1-2]。泡菜的獨特口感和豐富的營養價值贏得消費者的喜愛，但泡菜中的亞硝酸鹽等有害物質阻礙了泡菜的進一步發展[3]。原料中硝酸鹽的含量增加、發酵過程中的雜菌污染等因素都會造成泡菜中亞硝酸鹽含量增高。過量攝入亞硝酸鹽會導致高鐵血紅蛋白癥，同時長期食用高亞硝酸鹽含量的食品會增加患癌幾率[4]。因此，對于泡菜，控制和減少其亞硝酸鹽含量極其重要。

研究表明，乳酸菌能夠有效降解亞硝酸鹽，幾乎所有的乳酸菌都能產亞硝酸鹽還原酶(NiR)，在厭氧條件下可將亞硝酸鹽還原為NH4+或N2[5-8]。此外，乳酸菌是泡菜發酵過程中優勢種群之一[9-10]。乳酸菌產生乳酸等有機酸不但可以調節酸度，豐富泡菜口感，還可以抑制雜菌與部分有害菌的生成[11-14]。研究表明，泡菜是國內外乳酸菌菌種較為重要的來源之一，且乳酸菌用途較為廣泛[15]。乳酸菌或作為益生菌改善腸道微環境，或作為工業菌種進行傳統食品工業化，或作為功能性成分添加以期開發食品新品種。

本實驗采用傳統方法從泡菜中分離出乳酸菌，研究其降解亞硝酸鹽能力，探究其耐鹽、產酸和抗氧化等特性。該研究從泡菜中分離并篩選出具有亞硝酸鹽降解能力和抗氧化能力的優良乳酸菌，為低亞硝酸鹽泡菜的生產提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

泡菜(酸白菜)：取自湖北聚匯農業開發有限公司泡菜車間，用無菌袋收集，于4 ℃冰箱中保存備用。

1.1.2 試劑

硼砂、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、NaCl、HCl、DPPH、PBS：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；2×Taq Master Mix試劑(試劑中含有染料)：購于天根生化科技(北京)有限公司；細菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492R(5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)：均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.3 培養基

1.1.3.1 固體MRS培養基

蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏8.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.04 g/L，瓊脂粉15.0 g/L，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3.2 液體MRS培養基

蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏8.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.04 g/L，115 ℃滅菌20 min。

1.1.4 儀器

ZXSR-1270恒溫培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司；DELTA320 pH計、ME54E微量天平 梅特勒-托利多有限公司；HCB-1300V垂直層流超凈工作臺 海爾生物醫療股份有限公司；CR21N落地式高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；UV-1601紫外可見分光光度計 北京瑞麗分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

取發酵液100 μL加無菌水稀釋至1000 μL，并進行梯度稀釋，分別取10-4，10-5，10-6，10-7這4個梯度的發酵液200 μL，涂布于MRS培養基平板上，放入37 ℃恒溫培養箱中厭氧培養20 h后，用接種環挑取單菌落，平板劃線，37 ℃培養。重復劃線，傳代3次，得到單菌落，轉入MRS液體培養基，所得菌液按1∶1(菌液∶50%甘油)加入保藏管，編號，并于-80 ℃冰箱中保藏。

1.2.2 乳酸菌的鑒定

將1.2.1中甘油管中的菌株活化，并置于液體培養基中培養24 h。參照文獻[8]的方法進行16S rDNA分子生物學鑒定。PCR擴增條件：94 ℃ 1 min，98 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。

PCR擴增產物送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。將測序結果提交至NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進行BLAST同源性比對，選取同源性較高的模式菌株16S rDNA序列，采用MEGA 10.0軟件中的鄰接法(neighbor joining，NJ)構建系統發育樹。

1.2.3 降亞硝酸鹽的菌株篩選

將活化好后的菌株按1%接種量接種至亞硝酸鈉濃度為200 μg/mL的培養基中，37 ℃厭氧培養，分別在12，24，36，48，60，72 h取樣檢測亞硝酸鈉的含量。參考國標GB 5009.33-2016和文獻[16-17]采用鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽，并作改動。樣品預處理：取5 mL菌液于50 mL帶塞比色管中，加入飽和硼砂溶液12.5 mL，蒸餾水20.0 mL，混合均勻，置于沸水浴中加熱15 min。待冷卻后加入乙酸鋅5.0 mL搖勻，再加入亞鐵氰化鉀5.0 mL，加水至刻度線，搖勻。混合液倒入250 mL離心管中，并加水50 g，4000 r/min離心10 min；將溶液過濾，取中間澄清溶液供后續測定。樣品測定：吸取2 mL處理液于50 mL比色管中，加入40 mL蒸餾水，混勻。加入2 mL對氨基苯磺酸，搖勻，避光靜置5 min；加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液混勻，并加水到刻度線，避光靜置15 min，于波長538 nm處測定吸光度值，并對照標準曲線回歸方程計算亞硝酸鹽含量。

1.2.4 生長曲線的測定

將活化后菌株按1%的接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，并且每隔2 h測OD值。

1.2.5 耐鹽性的測定

耐鹽性[18]：將其按照1%接種量分別添加于含有0%、2%、4%、6%、8%、10%(W/V)NaCl的MRS液體培養基中，37 ℃ 恒溫培養36 h，于波長600 nm處測定吸光度值。

1.2.6 產酸能力的測定[19]

將活化好后的菌種按1%接種量接種至MRS液體培養基中，37 ℃培養 24 h，測發酵后的pH，實驗重復3次。

1.2.7 抗氧化分析

細胞懸浮液制備：菌種活化3代后，5000 r/min離心10 min，棄上清液，無菌水洗滌3次，重懸調整菌液濃度為1×108CFU/mL (OD595 nm=1.0)。

無細胞提取物制備：對細胞懸浮液進行離心破碎處理，電鏡檢查無完整細胞，離心收集上清液[20]。

1.2.7.1 DPPH清除能力的測定

根據參考文獻[21]略作改進：向2 mL待測液中加入0.2 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液2 mL，混勻，避光反應30 min，9000 r/min離心10 min，取上清液于波長517 nm處測吸光度值。其中對照組用純水代替DPPH，空白組用無水乙醇代替DPPH。

1.2.7.2 還原能力的測定

參考劉洋等[22]的方法：向0.5 mL待測液中依次加入0.5 mL 的0.2 mol/L PBS溶液(pH 6.6)、1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴20 min；迅速冷卻后加入0.5 mL的10%三氯乙酸，4000 r/min離心5 min；取上清液、蒸餾水、0.1%三氯乙酸各1 mL混勻，靜置，反應10 min，于波長700 nm處測定其吸光度值。吸光度值越大，還原能力越強。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離與鑒定

按照乳酸菌的菌落特征進行單菌落的挑選，隨后從樣品中共分離得到5株疑似乳酸菌菌株，分別命名為L2、L6、L7、L11和L18。經過鑒定，分別為醋酸菌、根瘤菌和乳酸菌，見表1；其中3株乳酸菌分別屬于兩個不同的屬，分別為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和明串珠球菌(Leuconostoc)。

表1 乳酸菌16S rDNA序列鑒定結果Table 1 Identification results of 16S rDNA sequences of lactic acid bacteria

確定實驗菌株為乳酸菌L7、L11和L18，從NCBI中查找其已知乳酸菌菌株的16S rDNA基因序列和其親緣性近的菌株16S rDNA基因序列，在MEGA 10.0中構建進化樹，結果見圖1。

圖1 乳酸菌的進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria

2.2 降解亞硝酸鹽能力

亞硝酸鹽是食品中較為關注的指標，也是發酵蔬菜中最容易產生的有害物質。3株乳酸菌在72 h降解亞硝酸鹽的能力見圖2，L7的降解能力為(114.19±2.46) mg/L；L11的降解能力為(104.26±3.68) mg/L；L18的降解能力為(128.70±4.85) mg/L。0～48 h時，亞硝酸鹽的含量會隨著時間的增加而減少。研究表明[23]，乳酸菌降解亞硝酸鹽的途徑可分為酸降解和產生亞硝酸鹽還原酶；當環境pH<4.0時，降解途徑才以酸降解為主；當環境pH>4.5時，降解途徑才以酶降解為主。結合實驗中24 h發酵后的pH值，分析可知實驗過程中兩種降解途徑都存在。

圖2 3株乳酸菌降解亞硝酸鹽能力Fig.2 Nitrite-degrading ability of three strains of lactic acid bacteria

2.3 生長曲線測定及產酸、耐鹽特性結果與分析

圖3 3株乳酸菌的生長曲線圖Fig.3 The growth curves of three strains of lactic acid bacteria

圖4 3株乳酸菌發酵后的pH值Fig.4 The pH values of three strains of lactic acid bacteria after fermentation

圖5 3株乳酸菌的鹽耐受性Fig.5 The salt tolerance of three strains of lactic acid bacteria

3株乳酸菌的生長曲線見圖3，L7、L11、L18在2 h時進入對數生長期，L11和L18均在12 h進入穩定期，而L7在接近18 h才進入穩定期；3株菌中，L18的生長活力最強。乳酸菌在泡菜發酵前期需要通過產酸來抑制不耐酸雜菌生長，后期需乳酸菌產酸調節口感，故乳酸菌的產酸能力是較為重要的發酵特性。培養24 h后，3株乳酸菌的pH結果見圖4，L18的產酸能力最強，L7的產酸能力最弱，但通過對比分析三者并沒有顯著性的差異(P<0.05)。因泡菜多加鹽水發酵制成，乳酸菌的耐鹽性這一發酵特性也值得研究。3株乳酸菌的耐鹽性結果見圖5，NaCl濃度為0%～10%范圍內時，3株乳酸菌的生長會因為NaCl增加受到抑制，NaCl濃度為0%～4%時，菌株L11和L18均能較好地生長；NaCl濃度為6%時，菌株L7比L11和L18生長情況要好，NaCl濃度>6%時，菌株幾乎不生長。

2.4 抗氧化特性結果與分析

DPPH清除率和還原性都是細菌抗氧化性能的評價指標，DPPH清除率結果見圖6，3株乳酸菌的還原性見圖7。3株乳酸菌的細胞懸浮液的DPPH清除率都高于無細胞提取物的清除率。其中，L7的細胞懸浮液的DPPH清除率最高并且已達到(52.47±1.04)%，最低的為L11細胞懸浮液(25.15±0.67)%。而無細胞提取物中L18的DPPH清除率最高，L11次之，L7最低。同一種菌株的細胞懸浮液與無細胞提取物比較：細胞懸浮液的清除能力強于無細胞提取物，L11的兩者差值最小，L7的差值最大，達到48.09%。3株乳酸菌的還原能力有一定差異，L18的還原能力最強，細胞懸浮液與無細胞提取物之間有較大差異。L7和L11的細胞懸浮液與無細胞提取物的還原性差異不大，且菌種之間的差異性也不大。

圖6 3株乳酸的DPPH清除率Fig.6 The scavenging rates of three strains of lactic acid bacteria on DPPH

圖7 3株乳酸菌的還原性Fig.7 The reducing capacity of three strains of lactic acid bacteria

3 結論

實驗分離篩選并通過分子鑒定得到3株乳酸菌，L7為腸膜明串珠菌亞種Leuconostocmesenteroidessubsp.jonggajibkimchii，L11為清酒乳酸桿菌亞種Latilactobacillussakeisubsp.sakei，L18為彎曲乳桿菌Latilactobacilluscurvatus。據有關報道[24-25]，彎曲乳桿菌Latilactobacilluscurvatus有良好的降解亞硝胺作用，并且已經成為國際公認的新食品原料；腸膜明串珠菌是發酵過程中的啟動菌種[26]，清酒乳酸桿菌也是發酵過程中十分重要的乳酸菌。實驗分離得到的3株菌中，L18菌株在降解亞硝酸鹽和還原性方面優于另外兩株菌，推測其細胞中具有良好的產還原酶性能，可進一步分析產亞硝酸鹽還原酶性能；L7菌株耐鹽性能和DPPH清除能力較好。經降解亞硝酸鹽能力及耐鹽性等發酵特性綜合分析，篩選得到的3株乳酸菌均可用于低亞硝酸鹽泡菜的生產。