高效耐鹽堿石油烴降解菌篩選及降解特性研究

王之語(yǔ)，原隴苗，劉艷紅，馬榮，吳應(yīng)琴

1.中國(guó)科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院/甘肅省油氣資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000

2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

0 引言

石油作為戰(zhàn)略物資和工業(yè)命脈，在現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)的發(fā)展中具有舉足輕重的作用。然而，由于不當(dāng)操作或事故造成的溢油污染事件頻發(fā)，給周邊環(huán)境造成了嚴(yán)重污染。石油烴是石油中最主要的成分之一，主要由烷烴、芳香烴構(gòu)成，也含有少量的含硫、含氮化合物。其中烷烴逐漸沉積到土壤、地下水與海洋中，極易造成持久性環(huán)境污染，還會(huì)對(duì)底棲生物造成威脅[1]，芳香烴中多環(huán)芳烴不但難以降解而且具有致癌性，會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，威脅著人類的生命健康[2]。同時(shí)，溢油會(huì)使土壤中總有機(jī)碳上升，碳氮比例失調(diào)，改變土壤的理化性質(zhì)從而影響土壤微生物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)，對(duì)土壤環(huán)境造成破壞。因此，石油污染土壤的修復(fù)具有潛在意義[3]。

目前，針對(duì)土壤石油污染的修復(fù)主要有物理、化學(xué)和生物修復(fù)[4￣6]，其中生物修復(fù)是通過(guò)生物代謝活動(dòng)來(lái)吸收轉(zhuǎn)化污染物，使其轉(zhuǎn)化為無(wú)毒無(wú)害的二氧化碳和水的方法[7]。相較于物理和化學(xué)修復(fù)而言，生物修復(fù)具有成本低、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)[8]。因此，本研究主要聚焦于生物修復(fù)中的微生物修復(fù)。目前已有超過(guò)兩百種具有石油烴降解能力的微生物被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，包括細(xì)菌、真菌、藻類等，且由于合成磷脂能力強(qiáng)，細(xì)菌對(duì)石油的降解效率往往遠(yuǎn)高于真菌和藻類[9]。不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)、假 單 胞 菌(Pseudomonas)、棒 桿 菌（Corynebacterium）、微球菌（Micrococcus）、節(jié)細(xì)菌（Arthrobacter）、產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes）等是常見的土壤石油降解細(xì)菌[10]。但微生物降解菌通常受環(huán)境因素的限制，如溫度、鹽度、pH 等，其最適pH 為7.0 左右，偏酸性或堿性都會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)及活性，同時(shí)高鹽度也會(huì)使微生物數(shù)量及成活率急劇下降[11]。Liet al.[12]在大慶油田附近的鹽堿土中分離出的耐冷嗜鹽性菌Planococcussp. ZD227 可利用苯及同系物作為碳源，張海榮等[13]從大港油田油泥中篩選出十株石油烴降解菌，研究發(fā)現(xiàn)過(guò)高pH值及鹽度均會(huì)嚴(yán)重影響大多數(shù)菌株的生長(zhǎng)。因此，要得到能在西北高鹽堿環(huán)境中對(duì)石油污染進(jìn)行原位修復(fù)的石油烴降解菌，則需從當(dāng)?shù)匚廴就寥乐泻Y選并培養(yǎng)出優(yōu)勢(shì)菌株。本研究選取長(zhǎng)慶油田為研究區(qū)域，該區(qū)域地處西北，由于常年干旱少水，鹽堿積累，土壤高pH、高鹽度等特性成了石油烴污染微生物修復(fù)的主要阻力[14]。因此，亟需一種低成本、高效、環(huán)保的修復(fù)方案來(lái)針對(duì)性地解決該地區(qū)鹽堿土壤的石油污染問(wèn)題。

研究通過(guò)對(duì)鄂爾多斯盆地長(zhǎng)慶油田附近的10個(gè)石油污染土樣進(jìn)行微生物培養(yǎng)，從中篩選出了4株高效原油降解菌株，并對(duì)其進(jìn)行生化理化試驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定。通過(guò)降解實(shí)驗(yàn)研究了其對(duì)原油不同組分（烷烴、芳烴）的降解特性及其抗逆性，為西北地區(qū)鹽堿土壤石油烴污染修復(fù)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 土壤樣品采集

實(shí)驗(yàn)所用土樣采自鄂爾多斯盆地長(zhǎng)慶油田周邊，分布在慶城縣和西峰區(qū)兩個(gè)區(qū)域（圖1）。供試土壤樣品總有機(jī)碳含量為3.12~4.12 g/kg，鹽度為1.43%~2.03%，pH為7.1~8.6，呈中性及弱堿性。具體采樣位置見表1。

表1 土壤樣品采集點(diǎn)Table 1 Collection sites of soil samples containing microorganisms

圖1 長(zhǎng)慶油田采樣點(diǎn)示意圖Fig.1 Schematic diagram of sampling points in Changqing Oilfield

1.1.2 培養(yǎng)基

PBS緩沖溶液（磷酸鹽緩沖溶液）：K2HPO42.75 g，KH2PO40.24 g，NaCl 8.14 g，用超純水定容至1 000 mL，pH為7.4，于121 ℃高壓滅菌20 min。

微量 元素溶 液：FeSO40.054 g，MnSO42.3 g，CuSO40.032 g，用超純水定容至1 000 mL。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO42.42 g，K2HPO47.3 g，（NH4）2SO42 g，NaCl 2 g，MgSO40.3 g，CaCl20.03 g，微量元素溶液1 mL，用超純水定容至1 000 mL，pH 為7.0。于121 ℃高壓滅菌20 min。

富集培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，超純水1 000 mL，pH 為7.4，于高121 ℃高壓滅菌20 min。

斜面保藏培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉15 g，超純水1 000 mL，

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高效石油烴降解菌的篩選、鑒定及理化性質(zhì)分析

（1）石油烴降解菌的初篩

將5 g 石油污染土壤接入裝有200 mL 無(wú)菌水錐形瓶中，于30 ℃，130 r/min 條件下恒溫震蕩培養(yǎng)24 h。然后取出5 mL上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入裝有100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，加入1.0%原油為唯一碳源，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)10 d。取5 mL培養(yǎng)液加入1.0%原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)7 d，如此轉(zhuǎn)接5次后。用1 μL接種棒以平板劃線法接種到固體富集培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，對(duì)長(zhǎng)出的菌種進(jìn)行計(jì)數(shù)。待菌落長(zhǎng)出后經(jīng)過(guò)多次劃線分離后得到單一菌株，接種于牛肉膏蛋白胨斜面上在4 ℃條件下保存，并將純化菌液與甘油1∶1混合后凍存于-80 ℃冰箱中保存。

（2）菌株鑒定及生化理化特征

將單株菌用平板劃線法接種到固體富集培養(yǎng)基上，觀察群落形態(tài)。然后用接種環(huán)取出小塊菌苔涂在滴加了無(wú)菌水的載玻片上，并對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其顏色和形態(tài)。根據(jù)已有資料[15]中的方法對(duì)分離的菌株進(jìn)行生化理化性質(zhì)鑒定

在純化后的菌體中提取細(xì)菌的基因組DNA，使用相應(yīng)的引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）/1492R（5’-TACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：滅菌蒸餾水22 μL，10×Buffer 2 μL，dNTP 1 μL，27F 和1492R 引物各1 μL，DNA 模板1 μL（30~100 ng）,Taq 酶25 μL。PCR 升溫程序設(shè)定為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次，72 ℃延伸8 s。擴(kuò)增產(chǎn)物由廣東美格基因科技有限公司使用ABI3730測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)BLAST結(jié)果用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 菌株對(duì)石油烴的降解

將菌株在100 mL 富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，用滅菌的PBS 溶液配制光密度為OD600=0.5 的純菌液，再以5%的接種量接種到無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)（此培養(yǎng)基以1.0%原油為唯一碳源）。以未接種菌株的培養(yǎng)基為對(duì)照組，每組設(shè)置3 個(gè)平行樣，在30 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)14 d后，用20 mL石油醚與樣品混合，經(jīng)搖床震蕩10 min、180 W 超聲波細(xì)胞破碎儀提取10 min 后，用分液漏斗進(jìn)行萃取。將萃取過(guò)程重復(fù)三次，合并萃取液，離心，Na2SO4去除水分轉(zhuǎn)移至容量瓶，待溶劑揮發(fā)后，再用石油醚定容至20 mL。充分搖勻后用移液槍取出200 μL樣品兩份，分別加入100 μL 0.3 mg/mL C24D50和500 μL 0.05 mg/mL 氘代萘（Nap-D）作為內(nèi)標(biāo)備用。利用安捷倫6890N（GC）/5973B（MSD）氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)樣品進(jìn)行分析。色譜條件：HP-5MS柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣，進(jìn)樣口溫度280 ℃，色譜柱程序升溫條件：80 ℃（恒溫1 min），以4 ℃/min 升至290 ℃（恒溫30 min）。進(jìn)樣量1.6 μL，無(wú)分流。質(zhì)譜條件為：增強(qiáng)型EI 源，電離能量70 eV，四極桿溫度：150 ℃；離子源溫度：230 ℃；質(zhì)量范圍：50~650 amu；譜庫(kù)：NIST12。掃描方式：全掃描。

在氣相色譜中不同物質(zhì)的相對(duì)豐度為該物質(zhì)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值[16]。降解率為降解前后物質(zhì)的相對(duì)豐度差值與降解前物質(zhì)相對(duì)豐度的比值。以未接種菌劑為對(duì)照組，由此可得到出石油烴各組分以及總石油烴降解率：

式中：A’EG為實(shí)驗(yàn)組內(nèi)標(biāo)物峰面積，AEG為實(shí)驗(yàn)組石油烴各組分峰面積，A’CK為空白組內(nèi)標(biāo)物峰面積，ACK為空白組石油烴各組分峰面積。

1.2.3 菌株抗逆性測(cè)試

用NaCl、NaOH、鹽酸配制不同鹽度（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%）及不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0、10.0、11.0）的富集培養(yǎng)基100 mL，每個(gè)梯度設(shè)置三個(gè)平行組，然后將菌株接種到培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r/min 下培養(yǎng)48 h，以滅菌的富集培養(yǎng)基作為對(duì)照組，每4 h 取樣，用紫外可見分光光度計(jì)（UV-6000）測(cè)量吸光度（λ=600 nm）。

2 結(jié)果與討論

2.1 石油烴降解菌的篩選

研究以長(zhǎng)慶油田采油廠周圍被石油污染的土壤為石油烴降解菌菌源，經(jīng)過(guò)5 個(gè)周期的馴化篩選后，將10 個(gè)樣品分離出的菌株的菌種數(shù)量進(jìn)行比較（表1）。除了1號(hào)樣品未篩選出石油降解菌，其余9個(gè)樣品都得到了不同數(shù)量的菌株。這可能是由于石化公司院內(nèi)采集的1號(hào)土壤樣為新鮮土壤，幾乎未遭受石油污染。而已有研究發(fā)現(xiàn)，與石油污染土壤相比，無(wú)污染土壤中石油降解細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較少，其數(shù)量不足微生物總量的百分之一[17]。

另外，通過(guò)對(duì)不同采樣點(diǎn)石油烴降解菌數(shù)量進(jìn)行比較，周邊有植物綠化的采樣點(diǎn)（4 號(hào)、5 號(hào)、6 號(hào)）較無(wú)綠化的采樣點(diǎn)（1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、7 號(hào)、8 號(hào)、9 號(hào)、10 號(hào)）來(lái)說(shuō)，經(jīng)馴化培養(yǎng)后可提取的石油烴降解菌的數(shù)量相對(duì)較多，說(shuō)明植物可能對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量和菌落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，這與很多學(xué)者研究的結(jié)果一致[18￣20]：說(shuō)明植物對(duì)細(xì)菌具有促生作用，因此，在石油污染修復(fù)過(guò)程中植物根系對(duì)有機(jī)污染物的附著作用提高了原油利用率，使石油烴降解菌群落更加豐富。3 號(hào)的油污土壤篩選菌株在富集平板上的種類、數(shù)量都相對(duì)較少，可能是高濃度的石油烴產(chǎn)生了較大的毒性所致。有學(xué)者指出，一定程度上的石油污染會(huì)使其污染土壤中有效石油降解菌得到富集，但高濃度的石油會(huì)對(duì)土壤和石油降解細(xì)菌產(chǎn)生毒性作用，明顯降低石油降解細(xì)菌的活性，甚至導(dǎo)致其死亡[21]。

2.2 石油烴降解菌生化理化特性

對(duì)初篩菌株進(jìn)行了復(fù)篩和降解率的計(jì)算。對(duì)其中降解率較高的4株降解菌進(jìn)行了生化理化鑒定（表2）。4 株降解菌均為革蘭氏陰性菌；吲哚試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、M.R 及V.P.試驗(yàn)均為陰性，接觸酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性，即四株菌株均為需氧菌或兼性厭氧菌，不能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，代謝葡萄糖過(guò)程中不產(chǎn)酸，且不能利用淀粉。可利用該結(jié)果對(duì)菌株的菌種進(jìn)行初步的判定。

通過(guò)菌落形態(tài)和顯微照片對(duì)4 株石油烴降解菌的理化特性進(jìn)行了進(jìn)一步的觀察（圖2，3）。菌株5-5為乳白色革蘭氏陰性菌，菌落邊緣整齊，單菌呈短桿狀。菌株5-X為乳白色革蘭氏陰性菌，菌落邊緣不規(guī)則，單菌呈短桿狀。菌株9-2 為乳白色革蘭氏陰性菌，菌落邊緣不規(guī)則，單菌呈桿狀。菌株10-3為乳白色革蘭氏陰性菌，菌落邊緣不規(guī)則，單菌呈短桿狀。結(jié)合表2生化理化鑒定結(jié)果，初步判斷5-5，5-X，10-3為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），9-2 為假單胞菌屬（Pseudomonas）。

圖2 4 株菌在富集平板上的菌落形態(tài)（a）5￣5；（b）5￣X；（c）9￣2；（d）10￣3Fig.2 Colony morphology of four strains on enrichment medium(a)5￣5;(b)5￣X;(c)9￣2;(d)10￣3

表2 石油烴降解菌的生化理化特征Table 2 Biochemical and physicochemical characteristics of petroleum hydrocarbon degrading bacteria

2.3 石油烴降解菌的16S rDNA測(cè)序

為了對(duì)石油烴降解菌的種屬進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，對(duì)4 株石油烴降解菌進(jìn)行了DNA 提取，PCR 擴(kuò)增和測(cè)序，與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)后，結(jié)果顯示5-5 為醋酸鈣不動(dòng)桿菌Acinetobacter calcoaceticus，與已發(fā)表菌株（MN250321.1）相似度為100%；5-X 為不動(dòng)桿菌Acinetobactersp.，與已發(fā)表菌株（MK602435.1）相似度為100%；10-3為乳酸不動(dòng)桿菌Acinetobacter lactucae，與已發(fā)表菌株（MH880845.1）相似度為100%；9-2 為蒙氏假單胞菌Pseudomonas monteilii，與已發(fā)表菌株（CP043396.1）相似度為100%。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，用MEGA 軟件對(duì)5-5、5-X、9-2、10-3 四株降解菌用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4，5）。

圖4 石油烴降解菌5-5、5-X、10-3 的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of petroleum hydrocarbon degrading bacteria 5-5, 5-X, 10-3

2.4 不同菌株對(duì)總石油烴的降解特性

14d 內(nèi) 菌 株5-5、5-X、9-2、10-3 對(duì) 總 石 油 烴（1.0%）的降解率分別為50.92%、51.27%、78.3%、44.39%（圖6）。同時(shí)，在降解過(guò)程中接種了這四種菌株的錐形瓶中均出現(xiàn)了原油的乳化現(xiàn)象，而接種其他菌株的對(duì)照組未出現(xiàn)該現(xiàn)象（圖7），這表明菌株可能會(huì)產(chǎn)生一些生物表面活性劑。這是由于部分微生物新陳代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生生物表面活性劑，可通過(guò)降低水相與有機(jī)污染物間的表面張力使疏水相在水相中充分分散，從而增大了菌株細(xì)胞膜與有機(jī)物間的接觸面積，從而提高碳源的利用率促使降解率升高[22]。在4 株降解菌中，菌株9-2 的降解率可達(dá)到78.3%，表現(xiàn)出了良好的降解效果，因此選定菌株9-2進(jìn)行進(jìn)一步研究。石油烴降解菌Pseudomonas monteilii9-2 已于2021 年10 月25 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)CGMCC No.23666。

圖6 菌株對(duì)石油烴的降解率Fig.6 Degradation rate of petroleum hydrocarbon by strains

圖7 菌株降解石油烴乳化現(xiàn)象（a）降解前；（b）對(duì)照組；（c）降解后Fig.7 Emulsification of petroleum hydrocarbon degradation by strains(a)before degradation;(b)control;(c)after degradation

2.5 菌株9?2對(duì)原油不同組分降解特性

為了研究菌株9-2 對(duì)石油烴不同組分的降解差異，分別對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組降解14 d 后的殘油成分進(jìn)行了GC-MS分析（圖8）。另外，為避免氣相色譜對(duì)不同類物質(zhì)的響應(yīng)度不同，選用了C24D50和Nap-D 兩種內(nèi)標(biāo)物分別進(jìn)行飽和烴和芳烴組分的計(jì)算。經(jīng)14 d 降解后，石油中各組分都有了大幅度地顯著下降，幾乎降解了全部正構(gòu)烷烴和大部分異構(gòu)烷烴（圖8），說(shuō)明菌株9-2 對(duì)原油中各組分的降解能力較好。

圖8 原油降解前后氣相色譜圖（a）降解前；（b）降解后（Nap￣D為內(nèi)標(biāo)物氘代萘，Pr為姥鮫烷，Ph為植烷）Fig.8 Gas chromatogram of crude oil before and after degradation(a) before; (b) after (Nap￣D: internal standard, deuterated naphthalene; Pr: pristane;Ph:phytane)

圖3 4 株菌經(jīng)革蘭氏染色后的顯微照片（a）5￣5；（b）5￣X；（c）9￣2；（d）10￣3Fig.3 Micrographs of four strains after Gram staining(a)5￣5;(b)5￣X;(c)9￣2;(d)10￣3

圖5 石油烴降解菌9-2 的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of petroleum hydrocarbon degrading bacterium 9-2

為了進(jìn)一步探討石油烴降解菌對(duì)原油中不同結(jié)構(gòu)碳鏈化合物降解的差異，分析了菌株9-2對(duì)原油中正構(gòu)烷烴、異構(gòu)烷烴和和芳烴的降解率（圖9），其降解率分別為94.65%、69.73%和59.07%，降解效果顯著。此結(jié)果反應(yīng)了菌株9-2 對(duì)正構(gòu)烷烴降解效率較高，對(duì)異構(gòu)烷烴和芳烴的降解相對(duì)較低。這是由于類異戊二烯烷烴的分支結(jié)構(gòu)比正構(gòu)烷烴的線性結(jié)構(gòu)更加具有抗生物降解的特性[23]。因此與異構(gòu)烷烴相比，石油烴降解菌9-2 更傾向于以正構(gòu)烷烴做為碳源，這與前人的研究結(jié)果相一致[24]。

圖9 不同組分石油烴的降解率Fig.9 Degradation rates of different components of petroleum hydrocarbon

另外，為了更進(jìn)一步地分析石油烴降解菌9-2對(duì)長(zhǎng)鏈、中長(zhǎng)鏈、短鏈正構(gòu)烷烴和多環(huán)芳烴的降解特性，分別計(jì)算了降解14 d 前后不同碳數(shù)的正構(gòu)烷烴的相對(duì)含量和不同芳烴衍生物的相對(duì)含量及其降解率（圖10~12）。經(jīng)過(guò)14 d 降解后nC13到nC20的正構(gòu)烷烴分別被降解了38.85%、69.88%、82.84%、90.38%、94.69%、98.13%、98.58% 和98.45%。降解前nC21到nC33正構(gòu)烷烴在石油烴中占到43.62%，降解后其含量均小于檢出限，說(shuō)明正構(gòu)烷烴基本被完全降解。這可能是由于菌株9-2 對(duì)nC21以上中長(zhǎng)鏈及長(zhǎng)鏈的正構(gòu)烷烴利用率相對(duì)較高；也可能是長(zhǎng)鏈烴在降解過(guò)程中被分解成短鏈烷烴，導(dǎo)致短鏈烷烴降解率較低。Throne￣Holstet al.[10]在一株能降解nC10-nC40正構(gòu)烷烴的不動(dòng)桿菌中分離出了參與長(zhǎng)鏈烷烴降解的基因almA，這表明不同編碼基因決定了不同細(xì)菌對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴和短鏈烷烴的降解潛力不同。但菌株9-2 降解中長(zhǎng)鏈烷烴的具體途徑還有待進(jìn)一步的研究。

圖10 菌株9￣2 降解原油前后不同碳數(shù)正構(gòu)烷烴在飽和烴中的相對(duì)含量對(duì)比Fig.10 Comparison of relative contents of n￣alkanes with different carbon numbers in saturated hydrocarbons before and after crude oil degradation by strain 9￣2

對(duì)于芳烴，14 d 內(nèi)菌株9-2 對(duì)萘、芘、菲、芴、?、苯并（k）熒蒽及苯并（e）芘及其衍生物分別降解了51.49%、62.41%、72.54%、60.86、74.53%、76.35% 及79.21%。?、芘、苯并芘、苯并熒蒽等4環(huán)以上芳烴降解率高于2~3 環(huán)。在微生物對(duì)石油烴各組分的降解中，一般對(duì)多環(huán)芳烴的降解要難于對(duì)單環(huán)芳烴和低分子量烷基芳烴的降解[25￣26]，因此高環(huán)數(shù)多環(huán)芳烴的降解也是多環(huán)芳烴污染修復(fù)的重點(diǎn)之一。但并非所有多環(huán)芳烴降解菌都遵循此規(guī)律，如閆雙堆等[27]以焦化廠周邊土壤為菌源篩選的11株降解菌對(duì)芘的降解率均高于對(duì)蒽的降解率，其中六株對(duì)菲的降解率高于對(duì)萘的降解率，一株對(duì)芘的降解率高于對(duì)萘的降解率，Govarthananet al.[28]分離得到的多環(huán)芳烴降解菌對(duì)芘的降解率（63.21%）高于對(duì)萘的降解率（60.12%）。在石油烴降解菌9-2的芳烴降解途徑中，結(jié)果也顯示芘系列等高環(huán)數(shù)芳香族物質(zhì)相比于萘系列等低環(huán)數(shù)物質(zhì)降解率更高。已有多個(gè)研究證明，某些高分子量多環(huán)芳烴具有轉(zhuǎn)化為低環(huán)數(shù)多環(huán)芳烴的降解途徑[29]。在菲的降解中，有生成萘衍生物中間體萘-1，2-二羧酸酸酐的潛力[30]。苯并[a]芘也可以通過(guò)還原生成7，8，9，10-四氫苯并[a]芘再生成芘，在4，5位上加氫生成4，5二氫芘生成中間體菲[31]。同時(shí)，苯并[a]芘也可以先生成中間體?，進(jìn)而再生成菲，最終降解為CO2和水[32]。因此，各多環(huán)芳烴衍生物降解率的差異也可能是新的低環(huán)數(shù)中間體的生成導(dǎo)致的。本研究所用的原油中，高環(huán)數(shù)多環(huán)芳烴的相對(duì)含量遠(yuǎn)低于低環(huán)數(shù)多環(huán)芳烴系列衍生物的相對(duì)含量。濃度不一致的情況下，盡管高環(huán)數(shù)多環(huán)芳烴的降解率大于低環(huán)數(shù)多環(huán)芳烴，但并不能證明石油烴降解菌9-2 對(duì)高環(huán)多環(huán)芳烴的效率高于低環(huán)數(shù)多環(huán)芳烴。然而，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明石油烴降解菌9-2具有降解高環(huán)多環(huán)芳烴的潛力，具體的降解途徑和機(jī)理還需進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。

2.6 菌株9-2的抗逆性

2.6.1 菌株的pH耐受結(jié)果

通常酸堿度是影響菌株生長(zhǎng)的重要外部因素之一。一般微生物在pH 在6.0~8.0 內(nèi)擁有較高的活性和降解率，超過(guò)此范圍微生物的性能和活性都會(huì)逐漸降低[11]，因此，只有篩選出能適應(yīng)當(dāng)?shù)厝鯄A性土壤條件的高效石油烴降解菌才能能大大提高其污染去除效率。在30 ℃、150 r/min下記錄石油烴降解菌9-2在不同pH條件下的生長(zhǎng)曲線（圖13）。研究發(fā)現(xiàn)，菌株在pH為7.0和8.0時(shí)快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)菌株生長(zhǎng)速度最快。在24 h 后，菌株濃度達(dá)到OD600=1.7 左右，此時(shí)菌株進(jìn)入衰亡期，開始出現(xiàn)菌株濃度下降的情況。而菌株濃度為OD600=1.5時(shí)進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，說(shuō)明衰亡期可能是由于受外界影響的同時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，菌株分解代謝超過(guò)合成代謝導(dǎo)致的。40 h后，菌株又重新進(jìn)入生長(zhǎng)期，這可能是由于外界影響因素解除導(dǎo)致的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，石油烴降解菌9-2在pH為3.0和4.0時(shí)不能生長(zhǎng)；在pH為11.0時(shí)，菌株生長(zhǎng)遲緩；在pH 為5.0~10.0 均表現(xiàn)出很高的生物活性，這表明該菌株能適應(yīng)的pH 范圍較寬，完全能適應(yīng)我國(guó)西北干旱地區(qū)土壤的堿性特征，適合作為西北地區(qū)石油污染的原位修復(fù)菌劑使用。

圖11 降解前后原油中不同芳烴及其衍生物的相對(duì)含量Fig.11 Relative contents of different polycyclic aromatic hydrocarbons and their derivatives in total polycyclic aromatic hydrocarbons in crude oil before and after degradation

圖13 菌株9￣2 在不同pH 條件下的48 h 生長(zhǎng)曲線Fig.13 48￣hour growth curve of strain 9￣2 at different pH values

圖12 菌株9￣2 對(duì)芳烴及其衍生物的降解率Fig.12 Degradation rates of polycyclic aromatic hydrocarbons and their derivatives by strain 9￣2

2.6.2 菌株的鹽度耐受結(jié)果

鹽度同樣是是影響菌株生長(zhǎng)重要條件之一，鹽度過(guò)高往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓改變，影響細(xì)菌生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致細(xì)菌脫水死亡。目前對(duì)于石油烴降解菌的耐鹽性也成為學(xué)者研究的重要方向之一：張寶寶等[33]從陜北地區(qū)石油污染土壤中分離的三株石油降解菌，對(duì)鹽度耐受度最高可達(dá)6.0%。Shiet al.[34]在餐廚油污中提取的銅綠假單胞菌P.aeruginosaM4 耐鹽度可達(dá)到7.0%。因此，為了篩選適合我國(guó)西北鹽堿地區(qū)石油烴降解菌株，本研究也進(jìn)行了菌株的鹽度耐受試驗(yàn)，在30 ℃、150 r/min條件下，記錄了石油烴降解菌9-2在不同鹽度條件下的生長(zhǎng)曲線（圖14）。在鹽度為0.5%~4.0%的范圍內(nèi)菌株9-2 生長(zhǎng)均表現(xiàn)良好，尤其在鹽度為0.5%時(shí)以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)最快，此時(shí)菌株濃度最高可達(dá)到OD600=1.728。16 h 后，鹽度在4.0%以下的培養(yǎng)基中菌株生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期，可能是由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足造成的，而鹽度在5.0%~6.0%的培養(yǎng)基中菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，石油烴降解菌9-2在0.5%~5.0%鹽度下生長(zhǎng)最適，在6.0%時(shí)生長(zhǎng)相對(duì)減緩，在7.0%鹽度下生長(zhǎng)遲緩。據(jù)文獻(xiàn)調(diào)查，我國(guó)西北地區(qū)的鹽度范圍大致在0.2%~3.1%[35￣36]，而菌株9-2可耐受6.0%以下的鹽度，這表明該菌株能可完全適應(yīng)西北干旱地區(qū)土壤的鹽度特征，適合作為西北地區(qū)石油污染的原位修復(fù)菌劑使用。

圖14 菌株9￣2 在不同鹽度下的48 h 生長(zhǎng)曲線Fig.14 48￣hour growth curve of strain 9￣2 at different salinities

3 結(jié)論

（1）從慶陽(yáng)市油井附近石油污染土壤中篩選出的4 株石油烴降解菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定確定為醋 酸 鈣不動(dòng)桿 菌5-5（Acinetobacter calcoaceticus）、不動(dòng)桿菌5-X（Acinetobactersp.）、蒙氏假單胞菌9-2（Pseudomonas monteilii）及乳酸不動(dòng)桿菌10-3（Acinetobacter lactucae）。

（2）四株降解菌在降解過(guò)程中均出現(xiàn)培養(yǎng)基原油乳化現(xiàn)象，其降解率分別達(dá)到了50.92%、51.27%、78.30%及44.39%。另外，石油烴降解菌9-2 的降解效果最顯著，可降解94.65%正構(gòu)烷烴，69.73%異構(gòu)烷烴和59.07%多環(huán)芳烴，并且對(duì)nC21以上中長(zhǎng)鏈及長(zhǎng)鏈烷烴和高環(huán)數(shù)多環(huán)芳烴的降解度更高。

（3）抗逆性試驗(yàn)結(jié)果表明，石油烴降解菌9-2 的酸堿度耐受范圍為pH 為5.0~10.0，鹽度耐受范圍為0.5%~6.0%。菌株9-2表現(xiàn)出優(yōu)越的降解率和耐鹽耐堿特性，可為西北地區(qū)鹽堿土壤石油污染微生物修復(fù)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

致謝 感謝國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No.42072180，41772147，41272147）及中國(guó)科學(xué)院儀器設(shè)備功能開發(fā)技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（No. E0280101）的聯(lián)合資助；感謝中國(guó)科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院馬曉峰老師、李樹同老師為本實(shí)驗(yàn)提供原油；同時(shí)感謝審稿專家對(duì)文章提出的寶貴意見。