基于微衛星引物鑒別不同地理種群玉米螟赤眼蜂和螟黃赤眼蜂

安仕博，陳 旭，戴 鵬，侯洋旸，臧連生，*

(1.吉林農業大學生物防治研究所，長春 130118；2. 貴州大學綠色農藥與農業生物工程教育部重點實驗室，貴陽 550025)

赤眼蜂Trichogrammaspp.屬膜翅目小蜂總科赤眼蜂科，是現代農林害蟲生物防治上應用范圍最廣、防治效果最好的天敵昆蟲(Smith, 1996)。目前已被廣泛應用于玉米ZeamaysL.、水稻OryzasativaL.、果蔬等多種農林害蟲的防控，并且表現出很好的生物防治潛能(何曉芳等, 2005; 張俊杰等, 2015; Zangetal., 2021)。赤眼蜂屬種類繁多，已報道有200余種，其寄主范圍廣泛，對鱗翅目農林害蟲的防治效果尤為顯著(邱益三, 1978; 李麗英, 1984; Pinto, 1999)。其中，玉米螟赤眼蜂Trichogrammaostriniae和螟黃赤眼蜂Trichogrammachilonis作為寄生亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)卵的優勢蜂種，是影響玉米螟種群消長的重要天敵因素(張荊等, 1990; 袁佳等, 2011)。目前，在我國東北地區，每年約有550萬ha的玉米田使用玉米螟赤眼蜂、螟黃赤眼蜂和其他赤眼蜂蜂種來防治亞洲玉米螟(Wangetal., 2014)。

赤眼蜂種類和品系的選擇是影響其田間防效的重要因素(王振營和周大榮, 1995; Hassanetal., 2004; Chailleuxetal., 2012)，其不同地理種群間生物學和生態適應性常存在較大差異，且具有豐富的遺傳多態性。為有效開發利用優勢種群、監測田間種群、避免赤眼蜂人工繁育中的蜂種混雜以及追蹤并評估其田間釋放后的防控效果，赤眼蜂的鑒定無疑是至關重要的 (Stouthamer, 2006)。赤眼蜂的鑒定方法主要包括形態學鑒定和分子生物學鑒定。由于體型小，且近似種間形態十分相近，這些因素給赤眼蜂的鑒定，尤其對于種內的不同地理種群的區分帶來困難。因此，目前赤眼蜂不同地理種群的區分，主要靠分子手段來實現(嚴智超等, 2020)。

由于赤眼蜂基因組基因數目龐大，進行全面的序列分析很難實現，需要利用DNA分子標記，對基因組中個別特征基因片段進行重點研究，因此選擇合適的分子標記片段是赤眼蜂分子鑒定及地理種群鑒別中關鍵所在。目前在昆蟲系統學研究中采用的DNA分子標記有微衛星DNA、核糖體DNA和線粒體DNA(余道堅等, 2003)。微衛星(Simple sequence repeat, SSR)，又稱簡單重復序列，是以1～6 bp核苷酸為重復單位的特殊序列。近年來，隨著分子標記技術的不斷發展，由于SSR在基因組中表現出高度的長度多態性和豐富的信息含量，以及雜合性高、側翼基因保守且操作簡單等特點，被應用于赤眼蜂分子鑒定研究中(代金霞, 2005; 瞿陸峰等, 2010; 柳瑩等, 2014)，如Lü and Han(2016)發現松毛蟲赤眼蜂TrichogrammadendrolimiMatsumura的26個多態性微衛星標記，用于分析松毛蟲赤眼蜂的遺傳變異，Pizzol等(2005)利用SSR分子標記區分突尼斯和法國不同地理種群的卷蛾赤眼蜂TrichogrammacacoeciaeMaechal。本研究基于微衛星標記技術，篩選出能夠快速區分不同地理種群玉米螟赤眼蜂和螟黃赤眼蜂的微衛星引物，為赤眼蜂種類和品系的選擇提供高效檢測手段和有力依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

2018年在黑龍江省、吉林省、遼寧省、廣東省和貴州省等地的玉米田中采集被寄生的玉米螟卵塊，待寄生的赤眼蜂羽化后根據雄性外生殖器特征鑒定(龐雄飛, 1985)，共采集到3種不同地理種群的玉米螟赤眼蜂和3種不同地理種群的螟黃赤眼蜂，分別是黑龍江玉米螟赤眼蜂(HLJ-To)、吉林玉米螟赤眼蜂(JL-To)、遼寧玉米螟赤眼蜂(LN-To)、貴州螟黃赤眼蜂(GZ-Tc)、黑龍江螟黃赤眼蜂(HLJ-Tc)和廣東螟黃赤眼蜂(GD-Tc)。將采集到的蜂種在25±1℃，相對濕度 70%±5%的條件下，以紫外光照射30 min殺胚處理過的新鮮米蛾CorcyracephalonicaStainton卵作為中間寄主連續繁育3代，后轉接玉米螟卵繁育1代進行復壯。

1.2 主要試劑和儀器

無菌水、CTAB試劑、核酸助沉劑、蛋白酶K、氯仿、異戊醇、無水乙醇、TE緩沖液、DNA Marker、丙烯酰胺、二叉丙烯酰胺和TBE緩沖液等試劑均采購于上海生工生物工程有限公司，所用SSR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

所用儀器有組織細胞破碎儀(杰靈TP-24)、高速低溫離心機(Eppendorf 5430R)、干式恒溫器(杭州瑞誠DH100-4)、PCR儀(Eppendorf 6333)、電泳儀(BIO-RAD 1645070)、垂直電泳槽(北京君意JY-JX5L)、超微量核酸蛋白測定儀(德國耶拿ScanDrop2)、水平搖床(北京六一WD-9405D)和膠片觀察燈(北京六一WD-9406)。

1.3 試驗方法

1.3.1赤眼蜂DNA的提取

參照CTAB法(Doyle and Doyle, 1987)提取赤眼蜂DNA，并進行改進，選取各地理種群赤眼蜂的成蜂，將單頭赤眼蜂放入1.5 mL離心管中，加入100 μL 2% CTAB溶液和適量研磨珠，放入研磨機中進行研磨(speed：3，time：50 s)，取出后每個離心管中加入2.5 μL蛋白酶K，55℃水浴2 h。水浴完成后加入100 μL氯仿異戊醇(氯仿 ∶ 異戊醇=24 ∶ 1)充分混勻，4℃離心10 min，取出后抽取上清液80 μL，加入160 μL無水乙醇和2.5 μL核酸助沉劑，置于-20℃冷凍2 h，取出后4℃離心15 min，棄掉上清液，金屬浴烤干后加入30 μL TE緩沖液進行溶解，使用ScanDrop2檢測DNA濃度和純度，并于-20℃冰箱保存備用。

1.3.2SSR引物的篩選

本研究所采用的微衛星引物均從玉米螟赤眼蜂和螟黃赤眼蜂的近緣物種松毛蟲赤眼蜂TrichogrammadendrolimiMatsumura(Lü and Han, 2016)開發的引物中進行選取，從中篩選出10對引物分別對玉米螟赤眼蜂和螟黃赤眼蜂DNA樣本進行PCR擴增，引物序列詳見表1。

1.3.3PCR反應

PCR反應體系為25 μL：提取的各地理種群赤眼蜂的DNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，2 × Taq MasterMix 12.5 μL，無菌水10.5 μL。PCR程序為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸20 s，共35個循環，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增后，產物用8%聚丙烯酰氨凝膠法，將膠板固定在電泳槽中，緩慢加入1×TBE至沒過膠面，用移液器分別吸取0.5 μL樣品加入點樣孔中。在500 V/20 A恒壓條件下電泳60～90 min，銀染顯影3～5 min后拍照，用Gene Mapper v4.0(Applied Biosystems，CA，USA)軟件對圖像進行處理和分析，得到各地理種群赤眼蜂微衛星各位點片段的大小和位置，篩選條帶明顯、清晰且可以區分各地理種群赤眼蜂的微衛星位點及引物。

表1 微衛星位點及引物特征

1.3.4數據分析

使用軟件GenAlEx version 6.5對等位基因數(Number of Allele, Na)、有效等位基因數(Effective Number of Allele, Ne)、觀測雜合度(Observed heterozygosity, Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity, He)及多態信息含量(Polymorphism information content, PIC)進行分析(Peakall & Smouse, 2012)；并用GenAlEx version 6.5和軟件CREATE將數據轉換為其它軟件后續分析所需的數據格式；基因多樣性(Gene diversity, Hs)使用軟件FSTAT Version 2.9.3.2(Lietal., 2010)進行分析。

2 結果與分析

2.1 玉米螟赤眼蜂3個地理種群的引物篩選

以玉米螟赤眼蜂DNA為模板，利用優化后的反應程序進行SSR-PCR引物1～10的篩選。根據擴增結果，淘汰擴增缺失條帶(引物2、7和9)、擴增效果不穩定(引物1和5)以及條帶位置相同(引物3、4和10)，其中引物6和引物8都可以穩定擴增出明顯且清晰的特異性條帶；在3種玉米螟赤眼蜂中，JL-To與LN-To之間無法區分，HLJ-To與其余兩種可利用引物6和引物8進行區分(圖1)。

圖1 玉米螟赤眼蜂3個地理種群的引物篩選結果Fig.1 Results of primer screening of three geographical populations of Trichogramma ostriniae注：每4條泳道對應1對引物的擴增結果，4條泳道分別對應Marker(M)、JL-To(A)、HLJ-To(B)和LN-To(C)。Note: Every four lanes corresponded to the amplification results of one pair of primers, and the four lanes corresponded to Marker (M), JL-To (A), HLJ-To (B) and LN-To (C)， respectively.

2.2 螟黃赤眼蜂3個地理種群的引物篩選

以螟黃赤眼蜂DNA為模板，利用優化后的反應程序進行SSR-PCR引物1～10的篩選。根據擴增結果，淘汰擴增缺失條帶(引物2)、擴增效果不穩定(引物1和引物9)以及條帶位置相同(引物4、5、6、7和10)，引物3和引物8都可以穩定擴增出明顯且清晰的特異性條帶；在3個地理種群的螟黃赤眼蜂中，HLJ-Tc與GZ-Tc和GD-Tc之間可以用引物3區分；GZ-Tc與GD-Tc和HLJ-Tc之間可以用引物8區分(圖2)。

圖2 螟黃赤眼蜂3個地理種群的引物篩選結果Fig.2 Results of primer screening of three geographical populations of Trichogramma chilonis注：每4條泳道對應1對引物的擴增結果，4條泳道分別對應Marker(M)、GZ-Tc(A)、GD-Tc(B)和HLJ-Tc(C)。Note: Every four lanes corresponded to the amplification results of one pair of primers, and the four lanes corresponded to Marker (M), GZ-Tc (A), GD-Tc (B) and HLJ-Tc (C)， respectively.

2.3 赤眼蜂4個微衛星位點的遺傳多樣性及多態性信息含量分析

赤眼蜂6個不同地理種群中能夠穩定擴增的4個微衛星位點的遺傳多樣性及多態信息含量見表2。4個微衛星位點TD3、TD6、TD8和TD10的多態信息含量(PIC)分別為0.141～0.746。其中TD8和TD10位點的PIC值分別為0.746和0.703，均大于0.5，均具有較高的多態性；位點TD3位點的PIC值為0.477，表現為中等多態性，而在TD6位點的PIC值僅為0.141，為低度多態性；4個位點平均PIC為0.517，整體表現為中度多態性。能夠穩定擴增的4個微衛星位點的平均等位基因數(Na)為1.5個，有效等位基因數(Ne)為1.5個，等位基因豐富度(Ar)為1.5個，平均觀測雜合度(Ho)為0.5，平均期望雜合度(He)為0.25。

表2 赤眼蜂4個微衛星位點的多態性特征

2.4 退火溫度對玉米螟赤眼蜂不同地理種群微衛星鑒定結果的影響

利用引物6和引物8按照上述反應程序，分別對玉米螟赤眼蜂3個地理種群的DNA模板進行擴增，并將退火溫度分別設為51℃、53℃、55℃、57℃和59℃。檢測結果表明(每條泳道上方的數字代表退火溫度)，退火溫度對引物6的PCR結果影響較大，當退火溫度超過55℃時，HLJ-To會出現明顯的條帶缺失，無法與其它兩個地理種群進行區分；退火溫度對引物8的PCR結果影響不大，玉米螟赤眼蜂3個地理種群均能在51～59℃的條件下擴增出明顯的特異性條帶(圖3)。

圖3 退火溫度對玉米螟赤眼蜂3個地理種群微衛星鑒定結果的影響Fig.3 Effects of annealing temperature on microsatellite detection of three populaitons of Trichogramma ostriniae

2.5 退火溫度對螟黃赤眼蜂不同地理種群微衛星鑒定結果的影響

利用引物3和引物8按照上述反應程序，分別對螟黃赤眼蜂3個地理種群的DNA模板進行擴增，并將退火溫度分別設為51℃、53℃、55℃、57℃和59℃。檢測結果表明(每條泳道上方的數字代表退火溫度)，退火溫度對各引物的PCR結果影響不大，3個地理種群的螟黃赤眼蜂均能在51～59℃的條件下擴增出明顯的特異性條帶，但是在55℃時差異最明顯(圖4)。

圖4 退火溫度對螟黃赤眼蜂3個地理種群微衛星鑒定結果的影響Fig.4 Effects of annealing temperature on microsatellite detection of three populations of Trichogramma chilonis

2.6 基于篩選微衛星引物對不同地理種群玉米螟赤眼蜂的鑒定結果

選取3個地理種群的玉米螟赤眼蜂成蜂各5頭，按照1.3中提到的方法提取DNA，分別利用引物6和引物8進行擴增，以鑒定不同地理種群的玉米螟赤眼蜂。結果表明(每5條泳道代表1個地理種群)，圖中引物6和引物8可以明確的區分出HLJ-To和JL-To以及LN-To之間存在的基因型差異，但JL-To和LN-To之間暫時無法區分(圖5)。

圖5 基于篩選微衛星引物對不同地理種群玉米螟赤眼蜂的鑒定結果Fig.5 Identification of Trichogramma ostriniae from different geographical populations based on microsatellite primers

2.7 基于篩選微衛星引物對不同地理種群螟黃赤眼蜂的鑒定結果

選取3個地理種群的螟黃赤眼蜂成蜂各5頭，按照1.3中提到的方法提取DNA，分別用引物3和引物8進行擴增，以鑒定不同地理種群的螟黃赤眼蜂。結果表明(每5條泳道代表1個地理種群)，引物3可以明確的區分出HLJ-Tc和GZ-Tc以及GD-Tc之間存在基因型差異，引物8可以明確的區分GZ-Tc和GD-Tc以及HLJ-Tc之間存在基因型差異(圖6)。

圖6 基于篩選微衛星引物對不同地理種群螟黃赤眼蜂的鑒定結果Fig.6 Identification of Trichogramma chilonis from different geographical populations based on screened microsatellite primers

3 結論與討論

物種對于環境的適應能力主要取決于其遺傳的多樣性。遺傳分化越豐富，對于環境的適應能力越強；反之，遺傳分化越單一，適應能力和生存潛力越弱(祖元剛, 1999)。本研究利用微衛星分子標記，篩選了可以用于區分不同地理種群的玉米螟赤眼蜂和螟黃赤眼蜂微衛星引物，并發現本研究涉及的不同地理種群的玉米螟赤眼蜂和螟黃赤眼蜂存在基因型的差異。

雖然微衛星位點的側翼區序列在種內具有高度的保守型，但在研究中發現，由于微衛星位點側翼序列突變或位點缺失、環境因素或PCR反應條件變化的影響，即使是相同物種的微衛星引物也會出現擴增失敗的情況(Paetkau and Strobeck, 1995; Raveletal., 2002; 門秋雷等, 2012)。本研究從已報道的10種微衛星引物中，選出4對可以擴增出穩定條帶的微衛星引物TD3、TD6、TD8和TD10(序列號：KT834822，KT834825，KT834827，KT834829)，但由于6個種群在TD10位點下擴增的條帶均相同，不適用于區分不同地理種群。雜合度是衡量微衛星位點遺傳多樣性的重要指標，兩者與微衛星位點的遺傳多樣性呈正相關。期望雜合度則能夠反映出不同遺傳結構之間的變異程度，一般將雜合度高于0.1的位點稱為多態位點。本研究中TD8位點的期望雜合度為0.333，具有較高的多態性和豐富的遺傳多樣性。而位點TD3和TD6的期望雜合度為0.083，為低多態性位點。多態信息含量(PIC)是衡量微衛星多態性的重要指標，當PIC>0.5時，該微衛星位點為高度多態性位點(Botsteinetal., 1980)。微衛星位點的PIC與該位點的可用性及使用效率相關，PIC越高，種群中該微衛星位點的雜合子比例越高，能夠提供的遺傳信息就越多。本研究中，除了TD6位點以外，TD3和TD8位點均具有中等到較高的多態性，能為赤眼蜂遺傳多樣性研究提供充分的遺傳信息。最終篩選出2對引物(序列號：KT834825，KT834827)可以區分HLJ-To與JL-To和LN-To，但JL-To與LN-To之間無法區分，初步說明這兩個地理種群之間的遺傳分化程度可能很低；同時也篩選出2對引物(序列號：KT834822，KT834825)可以區分GZ-Tc、GD-Tc和HLJ-Tc 3個種群。這說明幾種不同地理種群赤眼蜂間存在一定的基因型差異，可能與地理距離有關。

因赤眼蜂飛行能力弱，所以區域之間的基因交流程度低，且不同地理種群之間可能發生與寄主之間的協同進化，從而形成不同程度的遺傳差異性(李寶娟, 1992)。但本研究涉及的不同地理種群的赤眼蜂之間遺傳分化程度與地理距離的相關性還需要進一步的實驗驗證。本研究也發現不同退火溫度對于篩選出的引物的擴增效率影響不大，說明篩選出的引物對于退火溫度要求不高，特異性較強，但在利用引物6進一步鑒定和其它試驗中，建議使用退火溫度為55℃，以獲得最優的結果。

不同來源的寄生蜂由于受到環境因素的影響，其寄生能力、羽化率以及雌雄比等生物學特性之間往往存在較大的差異，從而影響對靶標害蟲的防治效果(Hassan, 1989; 董貝等, 2012)。在實際生產中，利用柞蠶卵作為繁育寄主可以有利于赤眼蜂的工廠化繁育，提高生產效率，同時降低成本。有研究表明，由于柞蠶卵卵殼較為堅硬，大多數的玉米螟赤眼蜂都無法寄生柞蠶卵，但有些地理種群的玉米螟赤眼蜂能夠寄生柞蠶卵，只是無法成功羽化(Hassanetal., 2004; 李樹英等, 2013)。最近的研究發現，玉米螟赤眼蜂和其它種類的赤眼蜂共寄生柞蠶卵可以幫助玉米螟赤眼蜂羽化出蜂，例如，與松毛蟲赤眼蜂共寄生柞蠶卵可以讓玉米螟赤眼蜂利用松毛蟲赤眼蜂的羽化孔完成出蜂(田春雨等, 2019)；而與螟黃赤眼蜂共寄生可以讓玉米螟赤眼蜂利用螟黃赤眼蜂的羽化孔完成出蜂(Iqbaletal., 2020)。這為今后高效繁育和利用玉米螟赤眼蜂提供了可能性和新的思路，但不同地理種群的玉米螟赤眼蜂和螟黃赤眼蜂之間的共寄生和輔助羽化的現象是否存在差異尚需進一步研究。

本研究篩選出的微衛星引物可以用于區分不同地理種群的玉米螟赤眼蜂和螟黃赤眼蜂的基因型差異，為精準鑒別玉米螟赤眼蜂和螟黃赤眼蜂不同地理種群奠定了基礎，同時也為進一步探尋優勢種群的高效繁育與應用技術提供了理論依據。